電針對(duì)帕金森大鼠行為學(xué)和中腦黑質(zhì)TH的影響

李霞 李靜 王永鳳 董保霞 張美英 劉礦平 吳培秀 楊繼軍

帕金森(PD)是常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常為主要特征［1］。主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)DA能神經(jīng)元逐漸變性死亡，紋狀體 DA含量下降［2］。PD在我國(guó)65歲以上人群患病率為2.05%。隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)老齡化的到來(lái)，PD發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，成為影響人類身體健康和生活質(zhì)量的重要疾病。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)4個(gè)月齡Wistar雄性大鼠，體重(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào):201103042)。動(dòng)物喂養(yǎng)使用河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的大鼠基礎(chǔ)飼料。在河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房飼養(yǎng)，室溫20～24℃，自然采光，通風(fēng)良好。

1.2 實(shí)驗(yàn)針具及藥物 華佗牌無(wú)菌不銹鋼毫針，φ 0.30 mm ×13 mm;韓氏 (HANS)電針儀，型號(hào)LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司;多巴絲肼片(美多芭)，上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)H10930198，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用0.9%氯化鈉溶液配制成所需濃度的混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 魚藤酮(RoteNone)，石家莊植物農(nóng)藥研究所，批號(hào):SZYC20100113R，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用二甲基亞砜配制成所需濃度的溶液;二甲基亞砜(DMSO)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):Q/HG3144-99;免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;HM-200型電子分析天平，日本AND;600型電熱恒溫水箱，天津;DW-40L262立式低溫冷藏箱，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司;2035型LEICA切片機(jī)，德國(guó);Citadel-2000包埋機(jī)英國(guó)姍頓公司;HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)，武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)。

1.4 方法

1.4.1 分組:78只Wistar大鼠均自然光照，自由飲水進(jìn)食，正常飼養(yǎng)1周后，根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］造模，隨機(jī)選取58只作為模型組大鼠，采用頸、背部皮下注射魚藤酮溶液 0.8 mg·kg－1·d－1(溶劑為二甲基亞砜，濃度為2 mg/ml)28 d制備PD大鼠模型;其余20只作為正常組注射等體積的溶劑。造模結(jié)束后，通過(guò)網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)和開闊實(shí)驗(yàn)對(duì)比模型組和正常組大鼠的行為學(xué)變化，模型組和正常組各隨機(jī)選取10只剖殺，觀察組織形態(tài)和神經(jīng)生化變化，以判定造模成功與否。造模成功后將模型組大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組和電針組。

1.4.2 治療方法:造模成功后，西藥組大鼠每天給予美多芭混懸液灌胃 1.67 mg·kg－1·d－1(溶劑為0.9%氯化鈉溶液，濃度為25 mg/ml);電針組大鼠每日按順序給予治療，將大鼠固定在自制束鼠器上，參照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》，選百會(huì)、三陰交、太沖穴，三穴均用φ0.30 mm×13 mm毫針刺入，接韓氏電針儀，電針正極接一側(cè)三陰交，負(fù)極接同側(cè)太沖，雙側(cè)相同，采用疏密波，頻率疏波 2 Hz、密波 80 Hz，強(qiáng)度 2.0 mA，10 min/次每天，西藥組和電針組均7 d為1個(gè)療程，共治療2個(gè)療程，療程間休息1 d;除西藥組外，其余各組均灌服等體積的0.9%氯化鈉溶液;除電針組外，其余各組均采用同一體位固定10 min·次－1·d－1。治療均由同一操作者操作。

1.4.3 取材:治療結(jié)束后，觀察大鼠包括懸掛實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)及開闊實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的行為學(xué)變化后，將大鼠脫臼處死取腦，左腦參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜，切取包含黑質(zhì)的腦組織(前囟后5.0～5.2 mm處)，放入備好的4%多聚甲醛的磷酸緩沖液中，固定1周以上。

1.4.4 行為學(xué)檢測(cè):懸掛實(shí)驗(yàn):根據(jù)參考文獻(xiàn)［4］，將大鼠兩前爪懸掛于距離地面1 m水平固定的繩子(直徑2 mm，長(zhǎng)100 cm)上，記錄大鼠落地前的時(shí)間，3 s內(nèi)大鼠跌落或僅一爪抓住繩子均屬失敗。根據(jù)參考文獻(xiàn)評(píng)分:0～4 s評(píng)0分;5～9 s評(píng)1分;10～14 s評(píng)2分;15～19 s評(píng)3分;20～24 s評(píng)4分;25～29 s評(píng)5分;超過(guò)30 s評(píng)6分。每隔5 min測(cè)1次，共測(cè)3次。

1.4.5 網(wǎng)格實(shí)驗(yàn):根據(jù)參考文獻(xiàn)［5，6］，選擇與水平面垂直的獨(dú)立金屬網(wǎng)格(面積80 cm×50 cm，網(wǎng)格大小1 cm×1 cm)作為實(shí)驗(yàn)裝置，將大鼠正立置于金屬網(wǎng)格中央，使大鼠位置與地面垂直，各趾爪均抓住金屬網(wǎng)格。用秒表記錄大鼠由靜止?fàn)顟B(tài)直至其任意一爪移動(dòng)時(shí)所花的時(shí)間，即為大鼠移動(dòng)潛伏期。每隔5 min測(cè)1次，共測(cè)3次。

1.4.6 開闊實(shí)驗(yàn):根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，將大鼠放置在大鼠籠內(nèi)，觀察大鼠自主活動(dòng)情況(持續(xù)150 s)，計(jì)測(cè)大鼠兩前肢離地累積的持續(xù)時(shí)間為大鼠直立時(shí)間;令大鼠四肢著地，頭與身體均保持靜止，計(jì)測(cè)其蹲于某一位置所積累時(shí)間，為大鼠靜止性蹲坐時(shí)間。

1.4.7 中腦黑質(zhì)TH免疫組化染色檢查:將在4%多聚甲醛的磷酸緩沖液中固定1周以上的中腦黑質(zhì)組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，切取6 μm厚的冠狀切片，先行HE染色，光鏡下觀察中腦黑質(zhì)組織形態(tài)學(xué)變化。再用S-P法行TH免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀察TH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠行為學(xué)觀察

2.1.1 懸掛實(shí)驗(yàn):治療前模型組、西藥組和電針組評(píng)分值均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);模型組、西藥組和電針組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后模型組評(píng)分值低于正常組(P＜0.01);電針組評(píng)分值均高于模型組(P＜0.01);西藥組評(píng)分值與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);電針組評(píng)分值與西藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 4組大鼠懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較分，±s

表1 4組大鼠懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較分，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

組別 治療前 治療后正常組(n=10)8.7 ±2.1 9.1 ±2.3模型組(n=11) 4.9 ±2.9* 5.2 ±2.2*西藥組(n=11) 3.8 ±1.7* 6.4 ±2.2電針組(n=11) 2.9 ±1.6* 7.9 ±1.6#

2.1.2 網(wǎng)格實(shí)驗(yàn):治療前模型組、西藥組和電針組大鼠移動(dòng)潛伏期均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組、西藥組和電針組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后模型組大鼠移動(dòng)潛伏期大于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);電針組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);西藥組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);電針組與西藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 4組大鼠網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)潛伏期比較分，±s

表2 4組大鼠網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)潛伏期比較分，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

組別 治療前 治療后正常組(n=10)5.1 ±2.7 4.6 ±2.7模型組(n=11) 9.6 ±3.6* 9.7 ±3.7*西藥組(n=11) 11.4 ±3.0* 7.7 ±3.4電針組(n=11) 8.9 ±2.7* 5.6 ±3.1#

2.1.3 開闊實(shí)驗(yàn):治療前模型組、西藥組和電針組大鼠靜止性蹲坐時(shí)間均高于正常組，站立時(shí)間均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);模型組、西藥組和電針組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后電針組和西藥組大鼠靜止性蹲坐時(shí)間均低于模型組，站立時(shí)間均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);電針組大鼠靜止性蹲坐時(shí)間與西藥組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，站立時(shí)間低于西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3、4。

表3 4組大鼠開闊實(shí)驗(yàn)-靜止性蹲坐時(shí)間比較分，±s

表3 4組大鼠開闊實(shí)驗(yàn)-靜止性蹲坐時(shí)間比較分，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

組別 治療前 治療后正常組(n=10)21±22 30±23模型組(n=11) 97±36* 109±21西藥組(n=11) 88±16* 37±22#電針組(n=11) 88±17* 51±9#

表4 4組大鼠開闊實(shí)驗(yàn)-站立時(shí)間比較分，±s

表4 4組大鼠開闊實(shí)驗(yàn)-站立時(shí)間比較分，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01;與西藥組比較，△P ＜0.01

組別 治療前 治療后正常組(n=10)97±31 94±20模型組(n=11) 40±34* 23±16西藥組(n=11) 34±20* 101±13#電針組(n=11) 24±26* 80±10#△

2.2 治療后4組大鼠中腦黑質(zhì)HE染色鏡下觀察

光鏡下:正常組DA能神經(jīng)元形態(tài)完整，細(xì)胞排列相對(duì)整齊;核呈圓形或錐形，大而清晰，核仁明顯;神經(jīng)纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)緊密。模型組神經(jīng)元部分輕度腫脹，體積增大，細(xì)胞間隙增寬;細(xì)胞核形態(tài)不一，體積增大，偏居一側(cè)，核仁不明顯，神經(jīng)纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)疏松。電針組與模型組相比中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元改善明顯，神經(jīng)元腫脹減少減輕，體積變小，細(xì)胞間隙變窄;細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，體積較正常，核仁較明顯，神經(jīng)纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)較密集，西藥組改善差于電針組，優(yōu)于模型組。電針組、西藥組均差于正常組。見圖1～4。

圖1 正常組(HE×100)

圖2 模型組(HE×100)

圖3 西藥組(HE×100)

圖4 電針組(HE×100)

2.3 治療后4組大鼠中腦黑質(zhì)TH免疫組化染色觀察 正常組TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕褐色，密集分布，數(shù)量較多，胞體較大，神經(jīng)元突起明顯。模型組TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，神經(jīng)元胞體輪廓及突起不清晰。電針組與模型組相比TH改善明顯，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增多，神經(jīng)元胞體輪廓及突起較清，西藥組改善差于電針組，優(yōu)于模型組。見圖5～8。

圖5 正常組(TH×400)

圖6 模型組(TH×400)

圖7 西藥組(TH×400)

圖8 電針組(TH×400)

3 討論

PD的治療中，L-DOPa替代療法和各種外科手術(shù)能夠在一定程度上改善患者癥狀，但不能阻止黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的持續(xù)丟失，更不能恢復(fù)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)目;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的使用，可以保護(hù)殘存DA能神經(jīng)元的功能;神經(jīng)干細(xì)胞移植和基因治療的研究，可以保護(hù)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元免于死亡和恢復(fù)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量，徹底逆轉(zhuǎn)PD的病理狀態(tài)，可能對(duì)PD的徹底治愈有所突破，期待有更好進(jìn)展。近年，有關(guān)針刺治療PD的實(shí)驗(yàn)研究和臨床報(bào)道越來(lái)越多，有報(bào)道針灸能引起PD大鼠黑質(zhì)和紋狀體區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生顯著增殖現(xiàn)象，且觀察到在增殖的神經(jīng)干細(xì)胞中有一部分轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元［8］，證實(shí)了針灸治療PD的有效性。

DA是DA能神經(jīng)元合成和釋放的主要功能性神經(jīng)遞質(zhì)，DA的合成過(guò)程以酪氨酸為底物，經(jīng)過(guò)TH羥化，多巴脫羧酶脫羧而成。因而TH是酪氨酸轉(zhuǎn)化成DA的關(guān)鍵限速酶，提高TH酶蛋白含量，促進(jìn)L-DOPA生成，增加DA含量及釋放量是治療PD的策略之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明電針百會(huì)、太沖、三陰交穴可增加黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和紋狀體DA的含量，對(duì)DA能神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明電針PD大鼠的百會(huì)、太沖、三陰交穴，一方面通過(guò)針刺太沖、百會(huì)發(fā)揮熄風(fēng)止顫的作用，改善PD大鼠的行為學(xué)變化，減輕PD大鼠的肌肉震顫、全身抖動(dòng)、四肢僵直等癥狀，另一方面通過(guò)針刺百會(huì)、三陰交達(dá)到滋補(bǔ)肝腎，填精益髓目的，使腦髓得以充養(yǎng)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PD大鼠TH增加相吻合，從PD發(fā)病機(jī)制的角度證實(shí)了PD的發(fā)病與腎虛髓空的關(guān)系，為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎養(yǎng)肝填髓，熄風(fēng)通絡(luò)止顫之法治療PD提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 李大年，焉傳祝，遲兆富，等主編.現(xiàn)代神經(jīng)內(nèi)科學(xué).第1版.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004.488.

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