TGF－β對(duì)AngⅡ調(diào)節(jié)人成纖維細(xì)胞Toll樣受體2表達(dá)中的影響

胡藝瓊 方玲 郭昌云 劉先哲 余旻 鮑容輝 李冠蘭 滕林 余靜

國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證明 AngⅡ與TGF－β關(guān)系密切，AngⅡ能促進(jìn)多種細(xì)胞中TGF－β的表達(dá)。AngⅡ修飾動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中炎性反應(yīng)的許多步驟而影響AS的發(fā)展［1］。大部分學(xué)者認(rèn)為TGF－β在AS中起保護(hù)性作用，即抑制AS中炎癥的發(fā)生，延緩AS的發(fā)展，活化的 TLR2促進(jìn)內(nèi)膜粥樣斑塊的形成［2－4］。本課題前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了AngⅡ能夠上調(diào)體外培養(yǎng)的HT－1080中TLR2表達(dá)。本次試驗(yàn)首次采用TGF－β和TGF－β的抑制劑Decorin刺激體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞，觀察TGF－β在AngⅡ促TLR2表達(dá)中的影響，從而在分子水平上探討AS的發(fā)病機(jī)制，并為臨床治療AS提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 HT－1080細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)(武漢典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù))，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，小牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，血管緊張素II(Sigma公司)，TGF－β(PeproTech Asia公司)，TGF－β抑制劑Decorin(R＆D公司)，Trizol試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;實(shí)時(shí)定量PCR各種試劑均購(gòu)自 Promega;DNA Maker購(gòu)自 TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 HT－1080的傳代培養(yǎng)及分組:收到定購(gòu)的細(xì)胞后先將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)內(nèi)用吸管全部吸出，置于另一無(wú)菌容器，再向培養(yǎng)瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到細(xì)胞脫落，換新的培養(yǎng)瓶，加入吸出的培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到90% 以上單層融合狀態(tài)時(shí)，即可加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分為:①正常對(duì)照組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT－1080細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液5 ml)，正常培養(yǎng)至24 h。②陰性對(duì)照組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT－1080細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液4.4 ml)，待細(xì)胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細(xì)胞分別加入高壓滅菌的PBS溶液100 μl，培養(yǎng)4 h后每瓶細(xì)胞內(nèi)加入高壓滅菌的三蒸水500 μl，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。③AngⅡ刺激組:取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT－1080細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液4.4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中4瓶細(xì)胞加入高壓滅菌的PBS溶液100 μl，恒溫培養(yǎng)0.5 h 后 4 瓶細(xì)胞分別加入 10－3、10－4、10－5、10－6mol/L的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ加入培養(yǎng)瓶后分別濃度變?yōu)?10－4、10－5、10－6、10－7mol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。④TGF－β刺激組 取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT－1080細(xì)胞進(jìn)行1∶3傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中四瓶細(xì)胞分別加入 TGF－β100、10、1、0.1 μg/L 500 μl，恒溫培養(yǎng) 0.5 h 后四瓶細(xì)胞加入高壓滅菌的三蒸水500 μl(TGF－β加入培養(yǎng)瓶后分別濃度變?yōu)?10、1、0.1、0.01 μg/L)繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h。⑤Decorin+AngⅡ刺激組取2瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT－1080細(xì)胞進(jìn)行1∶3傳代(傳代后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為104/ml，每瓶接種細(xì)胞懸液4.4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中四瓶細(xì)胞分別加入 80、40、20、10 μg/ml的Decorin溶液100 μl，培養(yǎng)4 h后每瓶細(xì)胞內(nèi)加入10－5mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ濃度變?yōu)?0－6mol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.2.2 RT－PCR各組細(xì)胞按照上述分組方法處理后收集并提取總RNA采用Trizol試劑一步法抽提，并對(duì)抽提的RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以確定RNA的純度及完整性。RT－PCR采用兩步法:各組 RNA 定量2 μg、5 × 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μl、100 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)1 μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 處理水至總體積為18 μl，稍離心65℃溫育5 min后置于冰上，加入逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆轉(zhuǎn)錄60 min，94℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 緩沖液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.4 μl、滅 菌 三 蒸 水 9.6 μl、反 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 2 μl、4 μmol/L 上游引物 1 μl、4 μmol/L 下游引物 1 μl、Taqma探針 1 μl。PCR 反應(yīng)條件為:預(yù)變性 94℃3 min、變性95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)。TLR2上游引物序列:5’－CTACTGGGT GGAGAACCTTATGGT－3’，TLR2 下游引 物 序 列:5’－CCGCTTATGAAGACACAACTTGA－3’，cDNA長(zhǎng)度 77 bp，TLR2 探針序列:5’－CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC－3’;GAPDH 上游引物序列:5’－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3’，GAPDH 下游引物序列:5’－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3’，cDNA 長(zhǎng)度 225 bp，GAPDH 探針序列:5’－CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC－3’。PCR產(chǎn)物在2.5% 瓊脂糖凝膠電泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)成像(反應(yīng)體系由試劑公司提供，上兩屆師姐完善后留下的)。MMLV一般溫度較低，最適溫度是37℃;amv是42～55℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰性組TLR2基因的表達(dá)量與空白對(duì)照組基本相等(P＞0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 空白組和陰性組TLR2基因表達(dá)的對(duì)比

圖2 TLR2 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 AngⅡ作用于體外培養(yǎng)的HT－1080后發(fā)現(xiàn):該組細(xì)胞內(nèi)TLR2的基因表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 AngⅡ?qū)LR2基因表達(dá)的影響±s

表1 AngⅡ?qū)LR2基因表達(dá)的影響±s

注:空白組比較，*P＜0.01

空白組 陰性對(duì)照組 AngⅡ0.1 μmol/L AngⅡ1 μmol/L AngⅡ10 μmol/L AngⅡ100 μmol/L 1±0.282 1.123±0.130* 3.437±0.373* 4.882±0.388* 5.104±0.25* 5.629±0.288*

圖3 AngⅡ組TLR2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 TGF－β作用于體外培養(yǎng)的HT－1080后發(fā)現(xiàn):該組細(xì)胞內(nèi)低濃度(0.1、0.01 μg/L)TGF－β 促進(jìn) TLR2 的基因表達(dá)，且表達(dá)量高于空白對(duì)照組，高濃度(1.0、10 μg/L)TGF－β抑制 TLR2的基因表達(dá)，且表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 TGF－β對(duì)TLR2基因表達(dá)的影響±s

表2 TGF－β對(duì)TLR2基因表達(dá)的影響±s

注:與空白組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

空白組 陰性對(duì)照組 TGF－β0.01 μg/L TGF－β0.1 μg/L TGF－β1.0 μg/L TGF－β10.0 μg/L 1±0.282 1.123±0.130 4.564±0.333# 2.393±0.15# 0.856±0.065* 0.584±0.056#

圖4 TGF－β組及Decorin+AngⅡ組TLR2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 TGF－β抑制劑Decorin和AngⅡ聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的HT－1080后發(fā)現(xiàn):其TLR2的基因表達(dá)量高于空白對(duì)照組，其最高表達(dá)量高于單用同劑量AngⅡ刺激組的表達(dá)量(P＜0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

表3 TGF－β的抑制劑Decorin在AngⅡ?qū)LR2基因調(diào)控中的影響

3 討論

AS的炎癥浸潤(rùn)通常存在于動(dòng)脈壁的內(nèi)膜層和外膜層，作為動(dòng)脈外膜的最主要組成細(xì)胞，人成纖維細(xì)胞在動(dòng)物模型中參與了外膜炎性反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)外膜成纖維細(xì)胞的激活可促使AS早期病灶的形成［5］。

AngⅡ和TLR2在AS的進(jìn)展中都發(fā)揮了重要的作用，但二者在AS中之間存在何種關(guān)系還知之甚少。在關(guān)于腎素－血管緊張素系統(tǒng)在慢性環(huán)孢素腎病中作用的研究中Kyung等［6］發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能促腎臟中的炎癥因子表達(dá)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及TLR2mRNA和蛋白表達(dá)。

由以上研究結(jié)果，我們推測(cè)AngⅡ可促進(jìn)體外培養(yǎng)的HT－1080中TLR2的表達(dá)。本課題前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了AngⅡ能夠上調(diào)體外培養(yǎng)的 HT－1080中 TLR2表達(dá)。

TGF－β是可由多種細(xì)胞分泌多效性細(xì)胞因子，在許多生物學(xué)過(guò)程中都具有重要作用，且發(fā)現(xiàn)TGF－β具有激活炎癥反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)雙重作用。在高血壓的病理過(guò)程中TGF－β的轉(zhuǎn)錄及活化被提高，在AS的病理過(guò)程中TGF－β的轉(zhuǎn)錄即活化卻被抑制，是什么原因造成TGF－β被抑制目前還不清楚。是否由于TGF－β在這兩種疾病中的不同遭遇才誘使AngⅡ?qū)@兩種疾病產(chǎn)生不同的影響還未有可知。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF－β抑制劑Decorin增強(qiáng)了AngⅡ?qū)LR2基因表達(dá)，并且隨著其濃度的增加作用越強(qiáng)，TGF－β直接刺激組觀察到隨著TGF－β濃度降低TLR2基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，由此我們推斷TGF－β在低濃度時(shí)可與AngⅡ協(xié)同促進(jìn)HT－1080中TLR2的表達(dá)。但另一方面，還需用AngⅡ與不同濃度TGF－β共同作用，這樣才能更加準(zhǔn)確地知道TGF－β的作用到底是通過(guò)AngⅡ，或其他因子實(shí)現(xiàn)的，還是直接影響了 TLR2。目前關(guān)于 TGF－β－AngⅡ－TLR2之間調(diào)節(jié)的具體機(jī)制和信號(hào)通路還十分模糊，需通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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2 Dunzendorfer S，Lee HK，Tobias PS.Flow－dependent regulation of endothelial Toll－like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity.Circ Res，2004，95:684－691.

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4 Adam E，Peter S，Linda K.Curtiss Modulation of atherosclerosis in mice by Toll－like receptor 2.Clin Invest，2005，115:3149－3156.

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