以葡萄糖激酶為靶點治療2型糖尿病的實驗研究進展

劉慧麗，席守民

·綜述·

以葡萄糖激酶為靶點治療2型糖尿病的實驗研究進展

ProgressofExperimentalStudyonTreatmentofDiabetesMellitusType2byGlucokinaseasTarget

劉慧麗，席守民

目的探討以葡萄糖激酶為靶點治療2型糖尿病藥物的研究現(xiàn)狀。方法參閱國內(nèi)外發(fā)表的相關文獻，綜述葡萄糖激酶激活劑、葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白以及突變的葡萄糖激酶基因?qū)?型糖尿病治療的效果及影響。結(jié)果3種方法均能不同程度地調(diào)節(jié)2型糖尿病動物的血糖水平，但其具體作用機制及其副作用有待進一步研究。結(jié)論以葡萄糖激酶為靶點來調(diào)控血糖水平可能是一種安全有效的措施。

葡萄糖激酶；激活劑；調(diào)節(jié)蛋白；葡萄糖激酶基因；2型糖尿病

目前糖尿病的發(fā)病率在全球呈上升趨勢，已成為一種嚴重威脅人類生命健康的慢性疾病[1]?？诜堤撬幬锶珉p胍類、硫脲類以及注射胰島素治療2型糖尿病，均不能很好地控制血糖變化，甚至經(jīng)常出現(xiàn)低血糖狀況。因此尋找一種能夠有效調(diào)節(jié)血糖的方法成為近年來眾多科學家的研究熱點。葡萄糖激酶(glucokinase,GK)主要由肝細胞和胰腺細胞特異性分泌，其不但能夠催化細胞的葡萄糖磷酸化，還能促進胰島素分泌和加速體內(nèi)葡萄糖的分解代謝，具有調(diào)控體內(nèi)血糖平衡的功能。因此，以葡萄糖激酶為靶點來調(diào)控血糖水平可能是一種既安全又有效的措施[2]。

1 葡萄糖激酶激活劑

1.1葡萄糖激酶

GK又稱己糖激酶IV型，分子質(zhì)量52 kD，由448個氨基酸殘基組成，包含一大一小兩個結(jié)構(gòu)域，并含有兩種結(jié)合位點：一種是用以結(jié)合葡萄糖和MgATP2-，是葡萄糖分子磷酸化的活化位點；另一種是用來和小分子GK激活劑或生理性激活劑結(jié)合的變構(gòu)位點。通過對GK的晶體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)GK主要以3種構(gòu)象存在: 開啟型、超開啟型和關閉型。當GK呈現(xiàn)為超開啟型時，其處于非功能狀態(tài)，也就是穩(wěn)定狀態(tài)；當GK呈關閉型時，此時GK大小結(jié)構(gòu)域折疊，葡萄糖和MgATP2-同時存在并與之結(jié)合，其處于功能狀態(tài);開啟型狀態(tài)是GK在功能狀態(tài)與非功能狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的一個過渡構(gòu)象[3]。

作為葡萄糖感受器的GK，其99%在肝臟表達，受胰島素和胰高血糖素的調(diào)控，生物活性具有血糖依賴性，其對葡萄糖的親和力: [S]0.5(葡萄糖)=7.5 mmol/L。在肝細胞內(nèi)，GK是糖酵解和糖原合成第一步反應的限速酶。當葡萄糖濃度升高時可活化GK，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，進一步轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖參加后續(xù)糖酵解反應，生成乳酸或進入三羧酸循環(huán)，或者轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖，促進糖原合成及貯存。GK主要作用是通過增加肝臟對葡萄糖的利用和增強胰島素分泌兩條途徑來降低血糖，在血糖穩(wěn)態(tài)的維持過程中發(fā)揮重要作用[4]。

1.2葡萄糖激酶活性改變

GK作為一個關鍵酶在2型糖尿病動物模型研究中具有重要意義。Seoane等[5]發(fā)現(xiàn)自發(fā)性糖尿病模型ZDF(Zucker Diabetic Fatty，ZDF)鼠肝臟細胞中GK活性比正常組下降了40%，糖原合成速度和糖原含量均低于正常組；用含有GK基因的腺病毒轉(zhuǎn)染ZDF鼠使其GK過度表達，再對動物的糖代謝進行檢測發(fā)現(xiàn)，ZDF鼠的糖代謝恢復正常。改用Wistar大鼠作模型動物，同樣用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法使GK過度表達，發(fā)現(xiàn)糖原合成和糖酵解水平均明顯增強。Shiota[6]采用高脂、高糖、低膳食纖維飼料對C57BL/6正常小鼠喂養(yǎng)30周形成2型糖尿病模型，并以同樣飼料喂養(yǎng)轉(zhuǎn)GK基因小鼠，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GK基因組小鼠血糖和胰島素水平在30周時明顯低于正常小鼠組，也由此推斷正常組GK的活性明顯低于轉(zhuǎn)GK基因小鼠組。歐陽禮枝等[7]對Wistar大鼠進行高脂高熱量飼料喂養(yǎng)數(shù)周，使其產(chǎn)生胰島素抵抗，發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗組肝糖原水平降低，GK活性下降，采用免疫印跡方法檢測發(fā)現(xiàn)正常組GK表達量明顯高于胰島素抵抗組。

1.3葡萄糖激酶激活劑

近年來，有學者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)一些活性因子對GK有調(diào)節(jié)作用，在對GK的晶體結(jié)構(gòu)進行細致分析的基礎上，發(fā)現(xiàn)這些活性因子能夠與GK的某些氨基酸殘基如Lys169、Arg63、Tyr215等結(jié)合[8]，從而調(diào)節(jié)其活性。由此發(fā)現(xiàn)了一系列的化合物，這些化合物不僅能提高GK的活性，而且能夠降低血糖水平。2003年羅氏公司Joseph等[9]通過高通量篩選并經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了第一個葡萄糖激酶激活劑(GKAs)RO-28-0450，此后各種與GKAs相關的文獻和專利便層出不窮。到目前為止還未有GKAs藥物上市，但是已有多個化合物進入Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗[10]。酰胺類、苯并咪唑類、喹唑啉類、脲類、吡啶類以及肽類等是目前幾種主要的GKAs[11]。

1.3.1酰胺類 酰胺類是最常用的GK激活劑。該類化合物一般都含有一個酰胺鍵和一個含N雜環(huán)，一方面GK的Arg63骨架上羧基O與酰胺鍵上NH作為氫原子的供體結(jié)合；另一方面GK的Arg63骨架上NH與含N雜環(huán)上的N作為氫原子的受體結(jié)合,從而達到激活GK的作用。2005年Alexander等[12]研究發(fā)現(xiàn)激活劑LY2121260可使GK的最大反應速度(Vmax)增長40%，[S]0.5(葡萄糖)由6.8 mmol/L降至0.4 mmol/L。這些數(shù)據(jù)表明LY2121260呈劑量依賴性的降低健康Wistar大鼠的血糖水平。

1.3.2苯并咪唑類 此類化合物以2-吡啶基-1H-苯并咪唑為核心，其可與GK的Arg63形成N雜環(huán)，形成的N雜環(huán)類似GK酰胺類激活劑的氫鍵。Keijt等[13]研究發(fā)現(xiàn)化合物Compound3g的半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)為0.16 μmol/L(2.5 mmol/L葡萄糖),1 mg/kg即可有效地降低健康Wistar大鼠的血糖水平。Makoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)化合物Compound16p(R)的EC50為0.36 μmol/L (1.1 mmol/L葡萄糖)，口服Compound16p(R)(3 mg/kg)可有效改善Wistar大鼠的口服葡萄糖耐量。

1.3.3喹唑啉類 這類衍生物可與GK的Arg63相結(jié)合。由Tomoharu等[15]研究發(fā)現(xiàn)的衍生物Compound21d具有很好的激活GK作用，此衍生物的EC50為0.14 μmol/L(2.9 mmol/L葡萄糖)，對高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠口服Compound21d (10 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)其血糖水平明顯降低。

1.3.4脲類 以非手性氮原子替代酰胺類化合物中1位的手性α碳原子形成一系列脲素類衍生物。最常見是Urea26和Urea30，Arlindo等[16]發(fā)現(xiàn)，當葡萄糖濃度為5 mmol/L時Urea26的EC50為6.6 μmol/L，其對GK的最大激活倍數(shù)為3.3；而Urea30的EC50為11.5 μmol/L，最大激活倍數(shù)為3.8。采用C57BL/6J小鼠分別進行口服Urea26和Urea30各100 mg/kg,結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服Urea26組血糖降低34%,而口服Urea30組血糖降低22%，血糖降低幅度均高于正常對照組。

1.3.5吡啶類 吡啶類化合物能夠有效的激活GK，此類化合物由Array Biopharma公司合成。其中化合物Array-403由Thomas等[17,18]研究發(fā)現(xiàn)，當其濃度為5 mmol/L時GK的最大反應速率(Vmax)為正常對照組的134%，[S]0.5(葡萄糖)為0.93 mmol/L。給C57BL/6J小鼠分別口服3、10、30 mg/kg的Array-403，發(fā)現(xiàn)各組血糖水平也相應降低，且與葡萄糖濃度有很大關系，對其進行繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠沒有出現(xiàn)低血糖癥狀,其血脂和體質(zhì)量也沒有明顯變化。

2 調(diào)節(jié)葡萄糖激酶活性的多種蛋白

GK的活性不僅受GKAs的影響，也受多種蛋白調(diào)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)的葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(glucokinase regulatory protein，GKRP)、磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2(phosphofructokinase2/fructose biphosphatase2，PFK2/FBPase2)、促凋亡蛋白BAD等都影響著葡萄糖激酶的活性。

2.1葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GKRP) GKRP是影響GK活性最重要的一種蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于大鼠肝臟中。近年來在大鼠腦組織、胰腺組織中均發(fā)現(xiàn)有GKRP mRNA的表達[19]。Slosberg等[20]研究發(fā)現(xiàn)GKRP與GK結(jié)合降低了GK活性,主要原因是這種結(jié)合使GK存儲于胞核,胞漿中游離GK含量大大減少，因而GK活性降低；而1-磷酸果糖的增多可使GKRP活性降低，導致大量的GK釋放入胞漿,引起GK活性增強。 另一方面6-磷酸果糖增加又使GKRP活性升高并促進其與GK結(jié)合，這種不斷的結(jié)合和解離形成了葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)作用[21]。最重要的一點是GKRP對GK有很好的保護作用,并且不影響肝細胞內(nèi)GK的活性。

2.2磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2(PFK2/FBPase2) PFK2/FBPase2能與GK結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。2,6-二磷酸果糖的合成和降解受PFK2的催化作用，其可激活磷酸果糖激酶-1，促進6-磷酸葡萄糖進一步合成1,6-二磷酸果糖，引起糖酵解途徑加速[22]。Payne等[23]研究發(fā)現(xiàn)PFK2/FBPase2在肝臟中一方面可以使GK表達增強，主要通過2,6-二磷酸果糖來調(diào)控胰島素信號通路上的AKT磷酸化；另一方面其又可以增強游離GK的活性，主要是通過結(jié)合GK從而改變了GK在胞核和胞漿中的分布比例。在胰腺里PFK2/FBPase2對GK的mRNA雖然沒有任何影響，但Arden等[24]研究發(fā)現(xiàn)其主要是通過調(diào)控GK轉(zhuǎn)錄后翻譯影響其活性，另外這種相互作用也增強了胰島素的釋放，從而降低了血糖水平。

2.3促凋亡蛋白(BAD) BAD由Nika等[25]研究發(fā)現(xiàn)，主要在肝細胞和胰腺β細胞的線粒體膜上表達，它不但能與GK形成復合物而改變GK的活性，而且還可以調(diào)節(jié)葡萄糖刺激的線粒體呼吸，胰腺β細胞功能和胰島素分泌也可能會受到這種調(diào)節(jié)的影響。

3 葡萄糖激酶基因突變

近年來發(fā)現(xiàn)葡萄糖激酶基因的變異也是導致2型糖尿病發(fā)生的重要因素。對突變的葡萄糖激酶基因進行改造研究，發(fā)現(xiàn)其在治療2型糖尿病的過程中安全有效，研究者對其將有效控制血糖、最終治愈糖尿病方面抱有較大的希望。

肖梅芳等[26]通過Cre-loxP條件性基因打靶技術(shù)構(gòu)建了GK基因敲除型2型糖尿病小鼠模型。其模型鼠GK表達量下降35%，而其肝糖原含量比對照組下降了60%。研究提示重組GK基因可能成為治療2型糖尿病的方法之一。蔡夢茵等[27]為了研究2型糖尿病的發(fā)生與葡萄糖激酶基因突變的關系，選取MODY2家系成員進行取樣并且提取其基因組的DNA，然后對其進行PCR擴增，并且對目的基因也就是葡萄糖激酶基因5′端、3′端非翻譯區(qū)及1-10號外顯子直接測序，確認突變。結(jié)果在MODY2家系中發(fā)現(xiàn)GK-E339K突變，該突變與糖耐量異常和糖尿病的發(fā)生有一定關系。試驗顯示E339K位點靠近ATP結(jié)合位點Ser336，因此E339K很可能會影響GK與ATP的結(jié)合，改變GK的活性，這為治療2型糖尿病提供了基因理論上的基礎。2010年鄭泰山等[28]通過直接測序PCR產(chǎn)物的方法，篩查了GK基因啟動子區(qū)、內(nèi)含子/外顯子結(jié)合區(qū)及整個編碼區(qū)，結(jié)果在1個多發(fā)糖尿病家系中發(fā)現(xiàn)1個新的GK基因突變V5L。該突變位于肝臟特異性轉(zhuǎn)錄的GK基因的外顯子1b處，與糖尿病的發(fā)生表現(xiàn)為共分離，但此突變對GK功能的具體作用機制仍需進一步研究。姚雪霞[29]運用分子動力學模擬和隱性溶劑自由能計算的方法理論研究了GK的單點突變Y214C(Tyr214→Cys)，通過分析GK的Cα原子均方根浮動變化和動態(tài)相關性矩陣，確認Y214C突變可使原本處于活化狀態(tài)的GK的構(gòu)象穩(wěn)定性增強；通過包結(jié)自由能分析發(fā)現(xiàn)，Y214C突變還能夠增強葡萄糖與GK的包結(jié)親合力。Y214C活性突變的機制不僅讓人們在原子水平上有了更深一步的理解,并且也為將來治愈糖尿病提供了一定的理論參考。

4 存在問題

GKAs主要以肝細胞和胰腺細胞內(nèi)的GK為靶點，通過改變GK的Vmax或葡萄糖的親和力([S]0.5)調(diào)節(jié)GK活性，具有促進葡萄糖代謝和葡萄糖刺激胰島素分泌的雙重作用。目前已發(fā)現(xiàn)的GKAs均能很好地改善動物模型的血糖，但是對葡萄糖刺激胰島素分泌的影響大多還停留于細胞實驗的結(jié)果，對于動物體內(nèi)的實驗結(jié)果報道較少。而GKAs促進胰島素分泌是由于對胰島的一種過度使用，還是因為對胰島的保護作用，從而使其功能改善，還有待于進一步的證實。雖然Array-403已經(jīng)在動物實驗中明確不會引起低血糖，對肝功能和血脂無不良反應，但因為GKAs的雙重降糖作用以及對肝臟物質(zhì)代謝的影響，這些仍是化合物研發(fā)中必須注意避免的問題。

5 展望

以葡萄糖激酶為靶點治療2型糖尿病現(xiàn)在已經(jīng)成為了糖尿病研究的熱點之一。但不論是研究出更多新型的抗糖尿病藥物，如葡萄糖激酶激活劑，還是增強葡萄糖激酶的活性調(diào)控，又或者是通過對突變的葡萄糖激酶基因進行改造，都要建立在安全、有效、長久的基礎上，盡可能地去造福于人類。

[1]Greiner DL,Brehm MA,Hosur V,et al.Humanized mice for the study of type 1 and type 2 diabetes[J].N Engl J Med,2011,1245:55-58.

[2]Matschinsky FM,Bogumil Zelent,Nicolai Doliba,et al.Glucokinase activators for diabetes therapy[J].Diabetes Care,2011,34(2):s236-s243.

[3]Kamata K,Mitsuya M,Nishmura T,et al.Structural basis for allosteric regulation of the monomeric allosteric enzyme human glucokinase[J].Structure,2004,12(3):429-438.

[4]Zelent D,Najafi H,Odili S,et al.Glucokinase and glucose homeostasis proven concepts and new ideas [J].Biochem Soc Tans,2005,33(Pt1):306-310.

[5]Joan Seoane,Albert Barber,Newgard,et al.Glucokinase over expression restores glucose utilization and storage in cultured hepatocytes from male Zucker diabetic fatty rats[J].J Biol Chem,1999,274(45):31833-31838.

[6]Masakazu Shiota,Catherine Postic,Yuka Fujimoto,et al.Glucokinase gene ocus transgenic mice are resistant to the development of obesity-induced type 2 diabetes[J].Diabetes,2001,50(3):622-629.

[7]歐陽禮枝，陸付耳，劉文軍，等.小檗堿對胰島素抵抗大鼠肝臟葡萄糖激酶及其調(diào)節(jié)蛋白的影響[J].世界華人消化雜志，2007，15(8)：885-889.

[8]Grimsby J,Sarabu R,Corbett WL,et al.Allosteric activators of glucokinase potential role in diabetes therapy[J].Science,2003,301 (5631): 370-373.

[9]Joseph Grimsby,Matschinsky FM,Bogumil Zelent,et al.Research and development of glucokinase activators for diabetes therapy: theoretical and practical aspects[J].Handb Exp Pharmacol,2011,(203):357-401.

[10]Pharmprojects.Pharmaceutical R&D annual review 2010[EB/OL].http//www.Pharmprojects.2010-01-15.

[11]Futamura M,Hosaka H,Kadotani A,et al.An allosteric activator of glucokinase impairs the interaction of glucokinase and glucokinase regulatory protein and regulates glucose metabolism[J].J Biol Chem,2006,281(49):37668- 37674.

[12]Efanov AM,Barrett DG,Brenner MB,et al.A novel glucokinase activator modulates pancreatic islet and hepatocyte function[J].Endocrinol,2005,146(9):3696-3701.

[13]Takahashi K,Hashimoto N,Nakama C,et al.The design and optimization of a series of 2-(pyridin-2-yl)-1H-benzimidazole compounds as allosteric glucokinase activators[J].Bioorg Med Chem,2009,17 (19):7042-7051.

[14]Ishikawa M,Nonoshita K,Ogino Y,et al.Discovery of novel 2-(pyridin-2-yl)-1H-benzimidazole derivatives as potent glucokinase activators[J].Bioorg Med Chem Lett,2009,19(15):4450-4454.

[15]Iino T,Sasaki Y,Bamba M,et al.Discovery and structure-activity relationships of a novel class of quinazoline glucokinase activators[J].Bioorg Med Chem Lett,2009,19(19):5531- 5538.

[16]Castelhano AL,Dong H,Fyfe MC,et al.Glucokinase-activatingureas[J].Bioorg Med Chem Lett,2005,15 (15):1501-1504.

[17]Thomas A,DebbieA,StevenB,et al.Arry-403,a novel glucokinase activator with potent glucose-dependent anti-hyperglycemic activity in animal models of type 2 diabetes mellitus [EB/OL].North arolina,Array BiopharmaInc,2009-01-01.http://www.Array biopharma.com /documents /Publication/Pub Attachment318.

[18]Thomas A,DebbieA,StevenB,et al.Discovery of arry-588,a novel glucokinase activator with potent glucose lower inactivity in animal models of type2 diabetes mellitus [EB/OL].North Carolina,Array BiopharmaInc.[2008-08-06].http://www.Arraybiopharma.com/ documents/Publication/Pub-A-ttachment288.

[19]Elvira Alvarez,Isabel Roncero,Julie A Chowen,et al .Evidence that glucokinase regulatory protein is expressed and interacts with glucokinase in rat brain [J].J Neurochemistry,2002,80(1):45-53.

[20]Slosberg ED,Desai UJ,Fanelli B,et al.Treatment of type 2 diabetes by adenoviral mediated overexpression of the glucokinase regulatory protein[J].Diabetes,2001,50(8):1813-1820.

[21]Van Schaftingen E.A protein from rat liver confers to glucokinase the property of being antagonistically regulated by fructose 6-phosphate and fructose1-phosphate[J].Eur J Bichem,1989,179(1):179-184.

[22] Simone Baltrusch,Heike Schmitt,Anke Brix,et al.Additive activation of glucokinase by the bifunctional enzyme 6-phosphofructo-2-kinase//fructose-2,6-bis-phosphatase and the chemical activator LY2121260[EB/OL].http://www.Else vier.com/locate/biochempharm/2012-02-2.

[23] Victoria P,Catherin A,Wu Ch D,et al.Dual role of phosphofructokinase-2/fructose bisphosphatase-2 in regulating the compartmentation and expression of glucokinase in hepatocytes[J].Diabetes,2005,54(7):1949-1957.

[24]Arden C,Laura H,Hu Ang GC,et al.A role for PFK-2/FBPase-2 as distinct from fructose 2-6-bisphosphate in regulation of insulin secretion in pancreatic β-cells[J].Biochem J,2008,411(1):41-51.

[25]Danial NN,Walensky LD,Zhang CY,et al.Dual role of pro-apoptotic BAD in insulin secretion and beta cell survival[J].Nat Med,2008,14(2):144-153.

[26]肖梅芳，張學梅，白香，等.不同糖尿病模型小鼠糖原代謝變化的研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10(6)：613-616.

[27]蔡夢茵，梁華，沈云峰，等.一個新的葡萄糖激酶基因——E339K突變導致的中國人青少年發(fā)病的成年型糖尿病2型家系[J].中華內(nèi)科雜志，2009，48(9)：721-723.

[28]鄭泰山，楊震，吳松華，等.中國人早發(fā)及多發(fā)糖尿病人群中葡萄糖激酶基因篩查及1個新的錯義突變V5 L的發(fā)現(xiàn)[J].中國糖尿病雜志，2010，18(9)：660-664.

[29]姚雪霞.葡萄糖激酶Y214C活性突變的理論研究[J].中國科技核心期刊，2010，21(6)：71-75.

2014-04-14

河南科技大學醫(yī)學院，河南洛陽 471003

劉慧麗(1986-)，女，河南洛陽人，在讀碩士研究生，從事疾病的分子機制研究。 通信作者：席守民，男，副教授，碩士生導師，E-mail: xishoumin1968@163.com

R587.1

B

1672-688X(2014)04-0317-04