豇豆葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及其在近緣種的通用性研究

潘磊　李依　郭瑞等

摘 要：從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載豇豆葉綠體基因組，對(duì)其進(jìn)行全序列分析，揭示豇豆cpSSR的分布特點(diǎn)和基序特征，進(jìn)一步研究豇豆cpSSR在豆類植物中的通用性。研究結(jié)果表明，豇豆葉綠體基因組上共有52個(gè)微衛(wèi)星，主要分布于LSC區(qū)，且以A/T為單堿基重復(fù)基序的微衛(wèi)星為主；從豇豆的52個(gè)葉綠體微衛(wèi)星中篩選出8對(duì)多態(tài)性豇豆cpSSR引物，在豌豆、利馬豆和菜豆中均成功擴(kuò)增，表明這些豇豆cpSSR引物在其豆類近緣種中具有較好的通用性。

關(guān)鍵詞：豇豆；葉綠體基因組；微衛(wèi)星；近緣種；通用性

中圖分類號(hào)：S643.4；S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2014）06-0009-07

豇豆（Vigna unguiculata）（2n=2x=22），又名豆角、長(zhǎng)豆角、帶豆等，屬豆科豇豆屬一年生草本植物。豇豆起源于非洲，中國(guó)是其次生起源中心，它在我國(guó)栽培歷史悠久，栽培面積大，南北各地均有分布。當(dāng)前，豇豆的DNA分子標(biāo)記研究在國(guó)內(nèi)外越來(lái)越受到關(guān)注[1]。特別是在豇豆的遺傳多樣性及品種（系）間的遺傳關(guān)系等研究方面，開展了多種分子標(biāo)記技術(shù)的研究，如RFLP[2]，AFLP[3]，RAPD（Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）[4，5]、ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間）[6]。近年來(lái)，借助比較基因組學(xué)的技術(shù)手段，研究者們將豇豆近緣種——普通豇豆SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）[7]和普通豇豆SSR（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）[8，9]等分子標(biāo)記，成功用于長(zhǎng)豇豆基因組的研究。

然而，豇豆核外基因組微衛(wèi)星標(biāo)記的研究，特別是葉綠體微衛(wèi)星（Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）標(biāo)記的發(fā)掘及其應(yīng)用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。Powell 等[10]首次提出葉綠體cpSSR標(biāo)記技術(shù)。與核基因組SSR標(biāo)記相比，葉綠體基因組DNA（Chloroplast genome DNA，cpDNA）呈單親遺傳模式、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、多拷貝、分子量小等特點(diǎn)，此外，cpSSR標(biāo)記還兼有核基因組SSR標(biāo)記的共顯性、 高度變異和多態(tài)性等特點(diǎn)，可以用于種質(zhì)資源分 類[11]、親緣關(guān)系鑒定[12]、遺傳多樣性[13，14]、遺傳結(jié) 構(gòu)[15]、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等研究[16，17]。

開發(fā)cpSSR標(biāo)記的傳統(tǒng)策略是構(gòu)建基因組文庫(kù)和測(cè)序，然后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行篩選，以獲得cpSSR引物，但是從植物組織中提取高純度cpDNA十分困難，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。當(dāng)前，采用生物信息學(xué)技術(shù)方法，充分發(fā)掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中的葉綠體基因組序列，根據(jù)cpSSR側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)篩選cpSSR引物是一條經(jīng)濟(jì)且便捷的途徑。

雖然豇豆全基因組測(cè)序尚未完成，但是豇豆葉綠體全基因組已經(jīng)測(cè)序完成并公布。本研究通過(guò)下載公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的豇豆葉綠體基因組全序列，分析豇豆葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和組分特征，揭示豇豆cpSSR組成與分布特點(diǎn)，并檢驗(yàn)豇豆cpSSR引物在豆科物種間的通用性，以便為豇豆cpSSR標(biāo)記在其近緣種的群體分化、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葉綠體微衛(wèi)星篩選

從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載豇豆（V. unguiculata）葉綠體基因組全序列（NC_018051），對(duì)豇豆葉綠體基因組全序列進(jìn)行分析，篩選微衛(wèi)星序列。單堿基微衛(wèi)星采用軟件Tandem Repeats Finder 4.04 查找[18]；多堿基微衛(wèi)星采用SSRhunter 1.3軟件進(jìn)行分析[19]，搜索條件按設(shè)置為單堿基微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)為10、二和三堿基的完全重復(fù)微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)分別為5和4、四堿基及四堿基以上的微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)均為3。在每個(gè)SSR位點(diǎn)的上下游側(cè)翼序列各為150 bp。

此外，采用DOGMA 軟件（Dual Organellar Genome Annotator）（http：//dogma.ccbb.utexas.edu/）對(duì)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2 cpSSR引物設(shè)計(jì)

基于所獲得的葉綠體微衛(wèi)星序列，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0（http：//frodo.wi.mit.edu/）分析微衛(wèi)星的側(cè)翼序列并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。主要參數(shù)設(shè)置為引物長(zhǎng)度18～22 bp，以20 bp為最佳；引物退火溫度50～60℃，以55℃為最佳，上游和下游的引物退火溫度之差在5℃以內(nèi)；GC含量40%～70%，最適為50%；預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～400 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 供試的豆類樣本材料

本研究在對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，采用了19份豆類種質(zhì)資源，包括10份豇豆材料，5份菜豆材料，3份豌豆材料和1份利馬豆材料（表1）。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳分析

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含有1×PCR buffer，20 ng DNA模板，4 nmol dNTP，30 nmol

MgCl2，引物10 pmol，0.5 U Taq DNA聚合酶[天根生化科技（北京）有限公司]。在Mastercycler gradient型PCR儀（德國(guó)，Eppendorf公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸5 min。

采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠（Acrylamide∶Bis=19∶1）檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚藍(lán)和 0.025%二甲苯青藍(lán)）等體積混合，在95°C變性5 min后，立即冰浴3 min，每次點(diǎn)樣量2.5 μL，恒功率55 W預(yù)電泳40 min，然后恒功率50 W電泳1.5 h。電泳完畢，經(jīng)過(guò)固定、銀染、顯色并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

電泳后，統(tǒng)計(jì)每一樣品擴(kuò)增的DNA 條帶數(shù)及其多態(tài)性，在同一電泳遷移位置上，有DNA 擴(kuò)增條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”。

2 結(jié)果與分析

2.1 豇豆葉綠體基因組cpSSR的分布

豇豆葉綠體基因組全序列分析表明，其基因組大小為152 415 bp，總GC含量為35.2%。豇豆葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)包括1個(gè)長(zhǎng)單拷貝序列（Long single copy sequence，LSC）、1個(gè)短單拷貝序列 （Short single copy sequence，SSC）及2個(gè)反向重復(fù)序列（Inverted repeat，IR）。其中，LSC約81 kb分布區(qū)域?yàn)?～81 468 bp，IRa約26 kb分布區(qū)域?yàn)?1 469～107 351 bp，SSC約19 kb分布區(qū)為107 352～126 250 bp，

IRb大約26 kb分布區(qū)域?yàn)?/p>

126 251～152 415 bp。

從豇豆葉綠體基因組上共搜索出52個(gè)微衛(wèi)星（表2），分布頻率為每2 931 bp有1個(gè)cpSSR；微衛(wèi)星核心重復(fù)區(qū)及側(cè)翼序列總長(zhǎng)度為16 213 bp，占基因組全長(zhǎng)的10.63%。豇豆cpSSR的分布范圍較大，從7 245 bp到152 001 bp都有分布，但是其分布并不均勻，主要集中在LSC區(qū)，少量的在SSC區(qū) ，而在IR區(qū)沒(méi)有。在LSC區(qū)和SSC區(qū)分布的cpSSR分別為48個(gè)（92.3%）和4個(gè)（7.7%）。

2.2 豇豆葉綠體基因組cpSSR的重復(fù)基序特點(diǎn)

根據(jù)微衛(wèi)星核心重復(fù)基序的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[20]，可將微衛(wèi)星可分為3種類型，即完美型、非完美型和復(fù)合型。完美型指的是微衛(wèi)星序列沒(méi)有中斷或附近沒(méi)有其他種類基序的重復(fù)序列；非完美型指的是同種重復(fù)基序被3個(gè)堿基以下的非重復(fù)序列所間隔；復(fù)合型指一種重復(fù)基序與其他種類的重復(fù)基序被3個(gè)以下的非重復(fù)序列所間隔。在所獲得的52個(gè)豇豆cpSSR中，完美型為48個(gè)，非完美型為4個(gè)，無(wú)復(fù)合型（表3）。這表明，在豇豆葉綠體基因組cpSSR中以完美型和非完美型微衛(wèi)星為主。此外，對(duì)核心區(qū)的重復(fù)次數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，重復(fù)次數(shù)的變化范圍為4～19次，其中核心重復(fù)次數(shù)為10次的微衛(wèi)星有14個(gè)（26.9%），而核心重復(fù)次數(shù)為11次的微衛(wèi)星有11個(gè)（21.2%），兩者累計(jì)所占比例為48.1%，幾乎占全部微衛(wèi)星數(shù)量的1/2。

依據(jù)重復(fù)基序的堿基數(shù)目差別，在這52個(gè)豇豆cpSSR中，單堿基重復(fù)基序微衛(wèi)星共有33個(gè)（完美型29個(gè)和非完美型4個(gè)），占63.5%，而 A和T是單堿基重復(fù)基序的主要類型，未見(jiàn)C或者G的單堿基基序（表3）。二堿基重復(fù)基序的微衛(wèi)星有14個(gè)，占26.9%，以AT和TA為主；三堿基重復(fù)基序有5個(gè)，占9.6%，堿基類型包括AAT（2個(gè)）、TTA（1個(gè)）、TAA（1個(gè)）、ATA（1個(gè)）。由此可見(jiàn)，在豇豆葉綠體微衛(wèi)星中，重復(fù)基序的堿基主要以A和T為主。

2.3 cpSSR引物的設(shè)計(jì)與篩選

利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0分析上述52個(gè)豇豆葉綠體微衛(wèi)星序列，從中設(shè)計(jì)并合成10對(duì)cpSSR引物，通過(guò)對(duì)10份豇豆樣品的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中8對(duì)cpSSR引物具有多態(tài)性（圖1），且PCR產(chǎn)物片段位于100～400 bp（表4）。

檢測(cè)上述8對(duì)多態(tài)性豇豆cpSSR在其近緣種中的可轉(zhuǎn)移性（圖2）。選取豇豆的3個(gè)近緣物種豌豆、利馬豆和菜豆（共9份樣品）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，這8對(duì)豇豆cpSSR引物均可以在這三3個(gè)近緣種中成功擴(kuò)增（表4）。

在豌豆中具有多態(tài)性的引物有CPM1、CPM3 和CPM6，均檢測(cè)到2個(gè)等位基因，其余5對(duì)cpSSR引物為單態(tài)性；在菜豆中具有多態(tài)性的引物有CPM1、CPM2、CPM4、CPM5和CPM7，也均檢測(cè)到2對(duì)等位基因，而其余3對(duì)cpSSR引物為單態(tài)性。

3 討論與結(jié)論

葉綠體基因組是單倍體，保守性較強(qiáng)，具有細(xì)胞質(zhì)遺傳的特點(diǎn)，除少數(shù)植物例外，一般為單親遺傳，不發(fā)生重組[21]。由于在進(jìn)化過(guò)程中，親代到子代的遺傳物質(zhì)傳遞不涉及基因組重組，不會(huì)受到選擇壓力，而且位點(diǎn)發(fā)生的突變也容易保留，不會(huì)受到重組、缺失以及假基因等的干擾[22]。因此，具有葉綠體基因組特征的cpSSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于在植物種質(zhì)資源鑒定、群體分化、系統(tǒng)分類和物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域[23，24]。

在cpSSR分子標(biāo)記的應(yīng)用上，其瓶頸和難點(diǎn)是引物的設(shè)計(jì)與篩選。與核基因組SSR引物的開發(fā)類似，cpSSR引物開發(fā)的前提是獲取微衛(wèi)星側(cè)翼的序列信息。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因組學(xué)的不斷進(jìn)步，當(dāng)前cpSSR分子標(biāo)記的開發(fā)主要有兩種策略，一是直接進(jìn)行葉綠體基因組測(cè)序，再設(shè)計(jì)篩選cpSSR引物；二是基于生物信息學(xué)手段，或者從公共數(shù)據(jù)庫(kù)的葉綠體基因組中發(fā)掘cpSSR引物，或者利用近緣物種的cpSSR進(jìn)行種間的可轉(zhuǎn)移性檢測(cè)，以獲取cpSSR引物。對(duì)于前者而言，由于葉綠體基因組DNA的分離和純化難度較大，增加了測(cè)序難度和成本，因此，后者利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源進(jìn)行葉綠體cpSSR標(biāo)記的開發(fā)，更加簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。特別是隨著開展全基因組測(cè)序的植物物種越來(lái)越多，許多植物的葉綠體基因組如擬南芥[25，26]、黃瓜[22]、蝴蝶蘭[27]、柑橘[28，29]、菜豆[30]等的全序列或者部分序列已經(jīng)釋放到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，極大促進(jìn)了cpSSR分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。

豇豆的葉綠體基因組全序列剛公布不久，這為揭示豇豆葉綠體基因組特征，并開發(fā)豇豆cpSSR分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。豇豆葉綠體基因組比較大（約153 kb），而一般植物的葉綠體基因組大小在120～170 kb[7，31]。

本研究通過(guò)對(duì)豇豆葉綠體全基因進(jìn)行微衛(wèi)星分布特征分析，發(fā)現(xiàn)在豇豆葉綠體基因組上分布有52個(gè)cpSSR，其序列總長(zhǎng)約占葉綠體基因組全長(zhǎng)的1/10。這些微衛(wèi)星在豇豆葉綠體基因組上分布不均，分布的密集區(qū)域?yàn)長(zhǎng)SC區(qū)，只有少數(shù)幾個(gè)微衛(wèi)星分布在SSC區(qū)，而在IR區(qū)無(wú)微衛(wèi)星分布。

這52個(gè)豇豆cpSSR在微衛(wèi)星的序列特征上，以A/T為單堿基重復(fù)基序的微衛(wèi)星為主（63.5%），也包括少量的二堿基重復(fù)基序類型AT/TA和三堿基重復(fù)基序類型AAT/TTA/TAA/ATA；重復(fù)次數(shù)的變化范圍為4次到19 次不等。因此，在豇豆cpSSR中，無(wú)論單堿基、二堿基或者三堿基重復(fù)基序，它們的堿基組成均以A/T為主要類型，未見(jiàn)C/G的堿基基序，而且重復(fù)次數(shù)變異范圍有限。cpSSR的這種堿基組成和重復(fù)特征可能與葉綠體的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)及其進(jìn)化有關(guān)聯(lián)。

由于葉綠體基因組序列在物種間具有較高的保守性，cpSSR引物可以在不同種屬間進(jìn)行跨種擴(kuò)增，具有通用性。Ishii等[32]研究表明，水稻cpSSR標(biāo)記在禾本科植物中具有較為廣泛的通用性。Diekmann等[33]從多年生黑麥草中發(fā)掘出9個(gè)cpSSR標(biāo)記并檢驗(yàn)其在黑麥草屬物種中的通用性。在園藝作物研究中，梁芳芳等[34]發(fā)現(xiàn)黃瓜cpSSR引物在其近緣種甜瓜、南瓜和西瓜中的通用性較好；Xue等[35]研究了中國(guó)蓮cpSSR在蓮屬中的通用性及多態(tài)性；Jiang等[36]從中國(guó)芒中開發(fā)出了在芒屬植物中具有通用性的cpSSR引物。而在木本植物研究中，韓鍵等[37]研究揭示了果梅cpSSR引物在李屬的桃、李、梅、杏、櫻桃等5個(gè)樹種中均具有通用性。

關(guān)于豆科植物的cpSSR分子標(biāo)記研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Angioi等[38]報(bào)道了所開發(fā)的菜豆屬cpSSR標(biāo)記的通用性，并分析了其在豆科的羽扇豆、花生、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆和豌豆中的通用性。當(dāng)前，對(duì)豇豆葉綠體基因組cpSSR分子標(biāo)記的研究尚未見(jiàn)正式報(bào)道。

因此，本研究初步嘗試對(duì)豇豆cpSSR分子標(biāo)記進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)篩選了8對(duì)多態(tài)性豇豆cpSSR引物，并在豇豆的近緣種豌豆、利馬豆和菜豆中成功擴(kuò)增，表明了這些cpSSR引物在不同豆類物種之間具有較為廣泛的通用性?？傊?，本研究分析了豇豆基因組微衛(wèi)星的序列組成和分布特點(diǎn)，并成功開發(fā)出具有種間通用性的豇豆cpSSR引物，這將為豇豆cpSSR分子標(biāo)記應(yīng)用于豆科物種開展群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化等研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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