海洋細(xì)菌Bacillus mojavensis 1A00437 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及功能研究

左懷雨，王茂淋，邵宗澤，李光玉，徐　柳，喻子牛，張吉斌

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物農(nóng)藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

β-1,3-1,4-葡聚糖是禾本科植物細(xì)胞壁的重要組成部分。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)是解聚β-1,3-1,4-D-葡聚糖的活性最高的內(nèi)切酶，屬于糖基水解酶16家族(GHF16)，可以精確水解和裂解地衣多糖或β-D-葡聚糖中位于β-1,3-糖苷鍵后的β-1,4-糖苷鍵。在啤酒發(fā)酵中，高分子量β-葡聚糖的殘留會(huì)導(dǎo)致啤酒原液黏度和濁度的增大[1]，黏度的增大會(huì)降低麥芽汁的過濾速率，而β-1,3-1,4-葡聚糖酶減小降低麥芽汁黏度。β-1,3-1,4-葡聚糖酶還被廣泛用作飼料添加劑，以大麥為主的飼料中添加β-1,3-1,4-葡聚糖酶，飼料的能量利用率可提高13%，蛋白質(zhì)利用率提高21%[2]，顯著提高了飼料利用率。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要存在于一些植物組織中，如大麥、稻米等[3]；另外，也來源于許多芽胞桿菌[3]，如Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Bacilluscirculans等，以及一些瘤胃細(xì)菌[4]，如Ruminococcusflavofaciens、Bacteroidessuccinogenes、StreptococcusbovisJB1[5]等；最近，在一些真菌、高等植物中也有發(fā)現(xiàn)。

細(xì)菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶在不同的宿主細(xì)胞中的表達(dá)均有報(bào)道，如Escherichiacoli、Bacillusspp.、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris以及轉(zhuǎn)基因大麥和煙草植物等。E.coli作為常規(guī)的原核表達(dá)宿主，常用于細(xì)菌基因的克隆和表達(dá)。Bacillusmojavensis1A00437是一株分離自太平洋的芽胞桿菌，其生長環(huán)境的特殊性使其具有特殊的研究價(jià)值。作者克隆了Bacillusmojavensis1A00437β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，研究其酶學(xué)特點(diǎn)，以期獲得具有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的葡聚糖酶。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料與試劑

Bacillusmojavensis1A00437由國家海洋局第三海洋研究所提供；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、小麥紋枯病菌(RhizoctoniasolaniAG8)及水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)，自行保存。

AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPCR Cleanup Kit，美國Axygen公司；Plasmid Midiprep Kit，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；T4 DNA Ligase、Ex TaqTMPolymerase、RNase A、EcoRⅠ、NotⅠ，大連寶生物工程有限公司；pMD18-T、pET-28a，Takara公司；Yeast extract、Typtone，Oxiod公司；Agarose，Biowest公司；β-葡聚糖，Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行序列搜索及相似性比對，依據(jù)已登錄的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)兼并引物并委托Invitrogen公司合成。引物序列如下：

bgl1：5′-ATGTCTTATCGTATGAAACGAGT-3′；

bgl2：5′-TTATTTTTTTGTATARCGYA-3′；

R=A/G，Y=C/T。

1.2.2基因組DNA 的制備及基因克隆

Bacillusmojavensis1A00437基因組DNA 制備參照細(xì)菌DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行。以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化(按照AxyPrepTMPCR Cleanup Kit試劑盒說明書進(jìn)行)。回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ca2+法制備的感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)后菌落PCR 鑒定，陽性克隆質(zhì)粒由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3序列分析

將測序得到的Bacillusmojavensis1A00437β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列用softberry、ORF finder等軟件分析其開放閱讀框，用BLASTEN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTEN)進(jìn)行序列相似性比對，Moe軟件進(jìn)行酶的結(jié)構(gòu)模擬和關(guān)鍵作用位點(diǎn)的分析。

1.2.4原核表達(dá)

根據(jù)陽性克隆測序結(jié)果，設(shè)計(jì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟表達(dá)引物。在引物5′端加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，并委托Invitrogen公司合成。引物序列如下：

Fbgl1:5′-CCGGAATTCATGAGTTTGTCTGCAGTCACTTCTA-3′；

Rbgl2:5′-AATGCGGCCGCTTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3′。

以帶有目的基因的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，同時(shí)與載體pET-28a進(jìn)行EcoRⅠ及NotⅠ雙酶切處理后于16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞及BL21感受態(tài)細(xì)胞。選取陽性克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定及雙酶切鑒定正確無誤后，以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，25 ℃誘導(dǎo)3 h。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE檢測。

1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，4 ℃、5 000 r·min-1離心3 min收集菌體，去上清后加入1/10原培養(yǎng)液體積的Binding buffer懸浮細(xì)胞，超聲破碎。收集粗蛋白液，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，吸取上清液于干凈的離心管中，用濾紙過濾后置于4 ℃?zhèn)溆?。蛋白純化按照GE公司的金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠6FF操作手冊進(jìn)行，SDS-PAGE 檢測各段收集樣品。對目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力測定

酶活力單位定義：在40 ℃、pH值5.5條件下，每分鐘從濃度為5 mg·mL-1的β-葡聚糖溶液中釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(1 U)。

將1 mL稀釋后的酶液和1 mL 8.0 g·L-1β-葡聚糖放入40 ℃水浴鍋平衡30 min。采用DNS法測定還原糖含量。

1.2.7β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

通過pH值為4.0～8.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液稀釋酶液測定最適pH值；pH值穩(wěn)定性通過β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖溶液中平衡不同時(shí)間(0 min,5 min,10 min,15 min,20 min,25 min,30 min)后測定，以0 min時(shí)的酶活為100% 酶活。稀釋酶液與8.0 g·L-1β-葡聚糖底物混勻，50 ℃反應(yīng)30 min，用DNS法測定并計(jì)算相對酶活。

將稀釋酶液分別在20～100 ℃平衡30 min測定最適溫度；將稀釋酶液在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃中分別保溫0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后測定熱穩(wěn)定性，以0 min時(shí)的酶活為100% 酶活；將稀釋酶液與底物混合，50 ℃反應(yīng)30 min，用DNS法測定并計(jì)算相對酶活。

金屬離子與化學(xué)試劑的影響測定：在酶促反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol·L-1的金屬離子(Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ni2+、Mn2+、Fe2+、Li+、Na+)和化學(xué)試劑(EDTA、SDS)，以未加金屬離子和化學(xué)試劑的酶活為100% 酶活，用DNS法測定并計(jì)算相對酶活。

底物專一性測定：選取β-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、幾丁質(zhì)作為底物并配制成濃度為8.0 g·L-1的溶液，用DNS法測定并計(jì)算各底物反應(yīng)條件下的相對酶活。

1.2.8β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗真菌活性測定

采用打孔對峙法，將病原真菌菌塊置于新鮮的固體培養(yǎng)基中央，并在培養(yǎng)基上用5 mm直徑打孔器均勻打孔6個(gè)，挑出瓊脂塊備用。待真菌菌絲生長至6個(gè)孔約1 cm處，吸取一定量的不同蛋白液和無菌水，分別加入到瓊脂平板已經(jīng)制備好的孔中。培養(yǎng)48 h，觀察抑制效果。

1.2.9β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響

將麩皮、稻糠、玉米粉分別過100目篩，將稀釋后的酶液和相應(yīng)的飼料底物混勻放入50 ℃水浴鍋平衡5 h。分別設(shè)置空白對照。通過DNS法測定還原糖含量，以確定β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1　bgl基因克隆

以Bacillusmojavensis1A00437的總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段，約為700 bp(圖1)，與預(yù)測的大小相符。擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，菌落生長后經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證(圖2)，結(jié)果正確。

2.2　bgl序列分析

將測序得到的基因序列用softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)、ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)等軟件分析其開放閱讀框，最后確定該酶基因的ORF為681 bp；NCBI序列比對后構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，分析Bacillusmojavensis來源的bgl基因的同源性。

M.DL 20001,2.target gene

圖1Bacillusmojavensis1A00437中bgl基因的克隆

Fig.1bglGeneclonedinBacillusmojavensis1A00437

M.DL 2000 1～6.different colonies verified by colony PCR

圖3　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的序列進(jìn)化樹

由圖3可以看出，Bacillusmojavensis來源的bgl基因與Bacilluslicheniformis來源的bgl基因具有高度的相似性，可達(dá)99%。

通過對氨基酸序列的分析，確定該酶屬于糖基水解酶16家族成員，理論pH值為6.05，蛋白大小為25.3 kDa，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的保守區(qū)域?yàn)镋-[LIV]-D-[LIVF]-x(0,1)-E-x(2)-[GQ]-[KRNF]-x-[PSTA],其中2個(gè)E是關(guān)鍵作用位點(diǎn)，本研究中酶的保守區(qū)域?yàn)镋IDIEFLGKDT，2個(gè)通過粗體標(biāo)明的E為該酶的活性位點(diǎn)氨基酸。該酶的保守區(qū)域和活性位點(diǎn)氨基酸如圖4所示。其中，保守區(qū)域以灰色表示，活性位點(diǎn)為Glu 133和Glu 137。

A.the front of substrate binding pocket

2.3　目的基因亞克隆

分別使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pMD18-T-bgl(E,N)和表達(dá)載體pET28a，然后將含有酶切位點(diǎn)的目的基因bgl和載體片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-bgl(E,N)。構(gòu)建好的載體圖譜如圖5所示。

圖5　重組質(zhì)粒pET28a-bgl(E,N)的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pET28a-bgl(E,N)用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，pET28a-bgl(E,N)經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后得到大小約為681 bp的bgl基因片段和大小約為5.3 kb的載體片段。載體測序結(jié)果表明，所有的目的基因在重組質(zhì)粒中的克隆方向、插入位點(diǎn)和閱讀框架正確。

M.DL20001,2.double-digest of pET28a-bgl(E,N)

圖6重組質(zhì)粒pET28a-bgl(E,N)雙酶切

Fig.6DoubledigestionofrecombinantexpressionvectorpET28a-bgl(E,N)

2.4　β-1,3-1,4-葡聚糖酶分離純化(圖7)

M.DL2000　1.the whole proteins of Bgl not-induced by IPTG

2.the whole proteins of Bgl induced by IPTG at 25 ℃3.purity protein

圖7SDS-PAGE分析Bgl蛋白的表達(dá)

Fig.7AnalysisofBglproteinexpressionbySDS-PAGE

由圖7可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，利用His標(biāo)簽分離純化后得到目的蛋白，融合表達(dá)的目的蛋白的大小與預(yù)測大小相近。

2.5　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的生物學(xué)特性

2.5.1pH值對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響(圖8)

由圖8a可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值6.5的反應(yīng)體系中具有最高的酶活力。

由圖8b可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在pH值5.0～7.0 的反應(yīng)體系中保持70% 以上的酶活力，并且在pH值5.5的反應(yīng)體系中相對酶活最高達(dá)到100%以上。

2.5.2溫度對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力和穩(wěn)定性的影響(圖9)

圖8pH值對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力(a)和穩(wěn)定性(b)的影響

Fig.8EffectofpHvalueonactivity(a)andstability(b)ofβ-1,3-1,4-glucanase

由圖9a可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在60 ℃時(shí)具有最高的酶活力。

由圖9b可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶在40～50 ℃區(qū)域內(nèi)保溫60 min后酶活力保持在80%以上；但當(dāng)溫度提高到60 ℃時(shí)，隨著保溫時(shí)間的延長酶活力發(fā)生波動(dòng)，60 min后酶活力下降到30%以下。表明該酶在40～50 ℃時(shí)比較穩(wěn)定，而在70～80 ℃時(shí)，酶活力在10 min內(nèi)迅速下降到30%以下，極不穩(wěn)定。

2.5.3金屬離子及化學(xué)試劑對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力的影響(圖10)

圖10　金屬離子和化學(xué)試劑對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力的影響

由圖10可知，Ni2+和Fe2+顯著增強(qiáng)酶活力，Cu2+、Ca2+、Mn2+對酶活力有明顯的抑制作用，其余金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力無顯著影響。

2.5.4β-1,3-1,4-葡聚糖酶底物專一性測定(表1)

表1不同底物的酶活力/(U·mL-1)

Tab.1Theenzymeactivityofdifferentsubstrates/(U·mL-1)

底物名稱β?葡聚糖木聚糖甘露聚糖幾丁質(zhì)酶活力16400001700200021

由表1可知，木聚糖、甘露聚糖、幾丁質(zhì)與β-葡聚糖相比，酶解效率極低，表明β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有嚴(yán)格的底物專一性。

2.6　β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能研究

2.6.1β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗真菌活性測定(圖11)

由圖11可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶對小麥紋枯病菌及水稻紋枯病菌菌絲的生長有顯著的抑制作用。

2.6.2β-1,3-1,4-葡聚糖酶對飼料消化率的影響(表2)

由表2可知，β-1,3-1,4-葡聚糖酶對稻糠、玉米粉具有一定的降解作用，能夠分解其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，利于飼料釋放其內(nèi)容物，以提高飼料的能量利用率。該實(shí)驗(yàn)為β-1,3-1,4-葡聚糖酶用作飼料添加劑提供了理論基礎(chǔ)。

A.水稻紋枯病菌　B.小麥紋枯病菌

表2β-1,3-1,4-葡聚糖酶降解飼料效果

Tab.2Feeddigestionresultsofrecombinantβ-1,3-1,4-glucanase

飼料稻糠玉米粉麩皮還原糖得率/%12716304

2.7　討論

邱思鑫等[6]研究發(fā)現(xiàn)，0.1～0.5 mmol·L-1的Ca2+對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力有顯著促進(jìn)作用，0.2～0.4 mmol·L-1Fe2+可提高該酶的酶活力。謝焱等[7]研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol·L-1的 Ca2+對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力無顯著影響，10 mmol·L-1的Fe2+對該酶的酶活力有顯著的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol·L-1Ca2+對酶活力有明顯的抑制作用，1 mmol·L-1Fe2+對酶活力有顯著促進(jìn)作用。另外，Ni2+也可顯著增強(qiáng)酶活力。造成這些差異的原因可能與菌株的生長環(huán)境相關(guān)，較特殊的海洋環(huán)境影響了菌株的某些遺傳特性，在實(shí)際應(yīng)用中可通過調(diào)節(jié)金屬離子濃度提高酶活力。

姚烏蘭等[8]從多粘類芽孢桿菌WY110(Paenibacilluspolymyxastrain WY110)菌株中分離純化出一種β-1,3-1,4-葡聚糖酶P2蛋白，該酶具有抗稻瘟病菌的活性，而重組酶對稻瘟病菌無抗性，但對小麥紋枯病菌及水稻紋枯病菌具有明顯抑制作用。P2蛋白與本研究中的重組酶相似性為77%，保守區(qū)域序列相同，不同之處應(yīng)為蛋白結(jié)構(gòu)序列。另有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對尖孢鐮刀菌、香蕉炭疽病菌、荔枝炭疽病菌以及出芽短梗霉的菌絲生長具有明顯的抑制活性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有相同的保守區(qū)域及活性氨基酸，其功能不同可能是其蛋白結(jié)構(gòu)不同造成的。造成該重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有不同抗真菌活性的原因可能為酶的結(jié)構(gòu)、底物專一性不同。另外，該重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對稻糠、玉米粉飼料具有一定的降解效果。

3　結(jié)論

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