結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)研究進展

董玉霞 閆寶環(huán) 彭景麗 鮑云波 沈顏紅

結(jié)核病是一個全球性的重要的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)WHO統(tǒng)計，每年全球約300萬人死于結(jié)核病。尤其是在最近十年，結(jié)核病在全球疫情又呈上升趨勢，對一些國家已構(gòu)成嚴(yán)重的健康威脅。因此，找到一種快速、特異的診斷方法，以控制結(jié)核病的傳播具有重要的意義。近年來隨著對結(jié)核病的研究的不斷深入和科學(xué)技術(shù)的不斷進步，實驗室診斷技包括細(xì)菌學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)三個方面有了很大的進展，綜述如下。

1 細(xì)菌學(xué)檢測方法

結(jié)核分枝桿菌的檢測是病原學(xué)診斷的可靠標(biāo)準(zhǔn)，并且可作為判斷結(jié)核病治療療效、結(jié)核活動的主要指標(biāo)。傳統(tǒng)的涂片鏡檢法、改良羅氏培養(yǎng)法等檢測方法雖然設(shè)備簡單、費用低廉等優(yōu)點，但往往有檢出率低，周期長等局限性［1］。在近十多年以來，針對結(jié)核分枝桿菌的特性，建立了一系列快速檢測系統(tǒng)。

1.1 Bactec檢測系統(tǒng)(包括460TBBactec、BACTEC MGIT 960TB、MB/BacTec)460TBBactec方法陽性率約為80%，比傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法(L-J法)明顯提高;檢測時間約9～14 d，明顯比 L-J法縮短［2］。但是因底物有放射性，易污染環(huán)境，且設(shè)備價格昂貴，不宜推廣。

BACTEC MGIT 960系統(tǒng)是集分枝桿菌快速生長培養(yǎng)、檢測及藥敏技術(shù)為一體的全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀。Rishi等［3-5］的研究結(jié)果顯示，該方法較固體培養(yǎng)法L-J法縮短了診斷時間并提高了診斷的敏感性。MB/BacTec系統(tǒng)是和BACTECMGIT 960系統(tǒng)相同，是應(yīng)用液體培養(yǎng)的系統(tǒng)，此系統(tǒng)對標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進行分離，和BACTEC-460系統(tǒng)相比，在肉眼下可看到結(jié)核桿菌生長，初分離率明顯提高，并且無放射污染，但是缺點是不能作菌型鑒定［6，7］。

1.2 噬菌體擴增法和噬菌體生物發(fā)光檢測 菌體擴增法是近年來新出現(xiàn)的用于檢測結(jié)核分枝桿菌中活菌的快速診斷方法，原理是:噬菌體在適宜條件下侵入標(biāo)本中活的結(jié)核桿菌體內(nèi)，在菌體內(nèi)進行增殖，游離的噬菌體以噬菌體殺滅劑殺死，此時加入快生長分枝桿菌，此時侵入細(xì)菌體內(nèi)的噬菌體大量繁殖，釋放出來，使結(jié)核桿菌指示細(xì)胞被感染、破壞、裂解，在電泳瓊脂版會出現(xiàn)噬菌斑。正常情況下，被加入噬菌體滅活劑后，因無噬菌體破壞指示細(xì)胞，使指示細(xì)胞在瓊脂版上均勻生長。據(jù)噬菌斑出現(xiàn)情況，判斷有無活菌生長，該方法靈敏度高，且不需要高致病菌的結(jié)核分枝桿菌和特殊設(shè)備，可用于快速檢測活的結(jié)核桿菌。賀瑜［8］應(yīng)用此方法檢測結(jié)核分枝桿菌進行流行病學(xué)調(diào)查，趙慶華等［9］采用噬菌體法和涂片法比較觀察269例住院肺結(jié)核患者療效，噬菌體法檢測結(jié)核分枝桿菌陽性57例，陰性212例;涂片法陽性60例，陰性209例。并且彌補了涂片法不能檢測死菌活菌的不足。

噬菌體生物發(fā)光法檢測原理:在分枝桿菌噬菌體中插入蟲熒光素酶的基因Efflux重組噬菌體，在大量噬菌體在標(biāo)本中獲得結(jié)核分枝桿菌內(nèi)繁殖時，因重組的噬菌體內(nèi)的蟲熒光素酶在體外與沖熒光素混合后，二者作用而發(fā)出熒光，發(fā)光強度以熒光素沒含量成正比，檢測發(fā)光強度經(jīng)幸噬菌體的定性定量分析，再以噬菌體量測定結(jié)核分支桿菌含量。此方法較直觀，但是必須使用標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)基和發(fā)光儀，并要求與常規(guī)檢測的最低抑菌濃度值一致。熊瑜等［10］收集89份糖尿病合并結(jié)核感染患者的痰、支氣管鏡鏡抽取液標(biāo)，應(yīng)用噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分支桿菌，同時作抗酸染色、并用VersaTREKTM細(xì)菌培養(yǎng)儀做分支桿菌培養(yǎng)。噬菌體生物擴增法和/或培養(yǎng)陽性的菌株32株做分支桿菌菌種鑒定。噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分支桿菌快速、特異、敏感，在糖尿病合并結(jié)核感染的快速診斷中有重要價值。

2 血清免疫學(xué)檢測方法

研究表明，結(jié)核病患者體液免疫反應(yīng)中特異性抗體水平明顯升高，因此可通過檢測患者血清中特異性抗體，鑒別疾病是否處于活動期，但是結(jié)核病中抗原多且復(fù)雜，因個體的免疫背景和疾病發(fā)展不同而異，可出現(xiàn)不同的抗體圖譜。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)LISA原理:在加入抗原或抗體吸附致固體的載體模板上，使標(biāo)本與酶結(jié)合物反應(yīng)，利用酶催化反應(yīng)產(chǎn)生底物的呈色，檢測抗體或抗原的方法。ELISA法檢測是應(yīng)用血清免疫學(xué)檢測患者患肺外結(jié)核的重要方法之一，在結(jié)核病血清學(xué)診斷方面研究最多、應(yīng)用最廣［11，12］。但總的來說其方法還不夠成熟，檢測使用的抗原不同(菌種不同、純化程度不同、抗原成分不同)、觀察對象、病程不同，導(dǎo)致其結(jié)果差異很大，敏感性及特異性尚不夠穩(wěn)定。Kashyap等［13］采用間接ELISA方法，應(yīng)用Ag85復(fù)合物的單克隆抗體檢測血清標(biāo)本中該抗原。陽幼榮等［14］應(yīng)用ELISA方法測定結(jié)核分枝桿菌重組Mtb81蛋白抗原，提高了其免疫學(xué)檢測的敏感性和特異性。

2.2 T-SPOT-TB試驗 以特異性抗原為刺激源，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)診斷結(jié)核感染的新方法。項杰等［15］據(jù)結(jié)核感染后體內(nèi)存在抗原特異性的記憶性T細(xì)胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時，迅速活化增值，釋放干擾素的原理，建立了以RDI編碼的結(jié)核特異性抗原6kD早期分泌靶向抗原(ES-AT-6)和10Kd培養(yǎng)濾過蛋白肽段庫為刺激源，檢測外周血中釋放結(jié)核特異性干擾素的T細(xì)胞，據(jù)此診斷結(jié)核感染。優(yōu)點是實驗結(jié)果清晰，易判斷，綜合敏感性較高，在免疫低下人群中、肺外結(jié)核的診斷中能維持較高敏感性［16］。另 TSPOT-TB能夠準(zhǔn)確鎖定需預(yù)防性抗結(jié)核治療的感染者，斑點越多發(fā)生活動性結(jié)核的可能性越大，短期內(nèi)半點明顯增多，提示體內(nèi)結(jié)核活動［17］，因此對于預(yù)防性治療十分必要。

2.3 結(jié)明(Myco DotTM)實驗 結(jié)明(Myco DotTM)實驗即結(jié)明三項(18KDa、16 KDa、LAM)，是國內(nèi)外使用較早、較普遍的結(jié)核抗體快速檢測方法。最早僅檢測LAM，以后發(fā)展為三項。原理:把含有抗原的電泳梳放入被檢測的血清中，如標(biāo)本中含有抗體，則抗原抗體結(jié)合，在把已結(jié)合抗原抗體的電泳梳，置于顯色液中，梳上附著抗原的部位就會出現(xiàn)紅色斑點，即為陽性。結(jié)核桿菌細(xì)胞壁上含有阿拉伯甘露糖，當(dāng)有結(jié)核病活動時，會呈現(xiàn)陽性紅斑，而既往曾患結(jié)核病者或卡介苗接種后、健康人不會出現(xiàn)紅斑，但是因試劑為進口試劑價格昂貴，難廣泛開展。

2.4 γ-干擾素釋放試驗 受檢者全血或外周血中單核細(xì)胞(PBMC)，在特異或非特異抗原在體外刺激下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ，用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)或酶聯(lián)免疫吸附法檢測IFN-γ血中的濃度或應(yīng)用計數(shù)分泌IFN-γ細(xì)胞的方法。目前該方法已經(jīng)在日本、英國、美國等地用于潛伏期肺結(jié)核和活動性肺結(jié)核感染者的診斷［18］。目前在臨床上不能準(zhǔn)確判斷卡介苗接種TST陽性結(jié)果，或TST陰性臨床結(jié)合病史影像學(xué)檢查不能排除結(jié)核病存在時，γ-干擾素釋放試驗可作為一項重要的輔助診斷檢查，但是價格昂貴，基層不易開展。

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù) 近二十年來，已經(jīng)有很多種PCR技術(shù)用于檢測結(jié)核分枝桿菌插入序列［19，20］。Elbir等［21］報道了一種簡單、快捷并且敏感的PCR序列，行PCR檢測前不需做DNA純化，直接把PCR反應(yīng)的混合物直接加入乙醇，應(yīng)用IS6110插入序列，檢測了44種標(biāo)本，全部陽性，簡化了試驗步驟，降低操作難度，敏感度特異性較高，是一種簡便快捷的基因檢測技術(shù)。尤其對于菌量少，有變異的易被常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢測方法漏診的病人，進行早期診斷、鑒別診斷，觀察治療療效，有重要臨床價值。PCR技術(shù)不足之處是易受外界同源DNA污染，非特異性擴增出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而由于細(xì)胞壁破環(huán)不徹底，或PCR抑制物存在，致出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此應(yīng)用PCR檢測應(yīng)結(jié)合臨床癥狀及其他輔助檢查，綜合分析以便明確診斷。

3.2 巢式 PCR技術(shù) 與普通PCR技術(shù)比較，巢式PCR技術(shù)有進一步發(fā)展，應(yīng)用兩對引物擴增完整的DNA序列，一對為PCR的引物，另一對為巢式引物。原理是第二對引物結(jié)合于第一對引物的內(nèi)部，使第二次擴增的產(chǎn)物較短，從而使擴增結(jié)果特異性更強。相對來說液體標(biāo)本巢式PCR檢測率更高，特異性更強，普通PCR和巢式PCR兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)巢式技術(shù)靈敏度、特異度較高。比較巢式PCR與抗酸染色兩種方法對可疑結(jié)核的固體石蠟組織檢測，發(fā)現(xiàn)此方法可提高檢出率。Schulz等［22］對190例中119例分枝桿菌DNA檢測陽性，其中71例符合典型結(jié)核桿菌;41例發(fā)現(xiàn)不典型分枝桿菌DNA。Azov等［23］應(yīng)用此方法檢測46例石蠟切片，對于抗酸染色法明確診斷的結(jié)核病例，靈敏度100%，尤其對結(jié)核桿菌復(fù)合群和鳥型分枝桿菌有特異性。對于不典型的肉芽腫性病例，該方法明確診斷9例，其中4例符合不典型結(jié)核桿菌。由此說明巢式PCR對于石蠟組織的結(jié)核桿菌檢測有重要意義。

3.3 實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù) 實時熒光定量，同時具有引物和探針的兩種特異性，對于細(xì)菌學(xué)檢測的特異性有明顯提高，自動完成Southern印記雜交，可提高基因的特異性。Pinsky等［24］介紹應(yīng)用多重實時熒光定量PCR方法鑒定牛分枝桿菌、人型結(jié)核分枝桿菌及卡介苗。檢測60例標(biāo)本中，57例為人型結(jié)核分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌，3例為卡介苗接種。Chang等［25］實時熒光定量PCR方法進行了人型結(jié)核桿菌和牛型結(jié)核桿菌鑒定。Takahashi等［26，27］對此方法和巢式技術(shù)進行比較，該方法吸收了巢式技術(shù)的優(yōu)點，避免了巢式PCR技術(shù)易受污染的缺點。盡管Real-Time PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測方面有許多優(yōu)勢，但由于其高靈敏性、實驗操作易受污染等而容易出現(xiàn)假陽性。但是實時熒光定量方法易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能僅此方法作為診斷依據(jù)，只有具有一定數(shù)量時才有臨床意義。

3.4 限制性片段長度多態(tài)性PCR檢測技術(shù) PCRRFLP是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，限制性內(nèi)切酶聯(lián)合鑒定技術(shù)綜合分析，鑒定分枝桿菌菌種的可靠方法。因此較常規(guī)方法更準(zhǔn)確、快速。Agacayak等［28］通應(yīng)用限制性內(nèi)切酶技術(shù)檢測65kD蛋白基因的PCR產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)能夠檢測出結(jié)核分枝桿菌屬種。Caws等［29］利用該技術(shù)進行了耐異煙肼的結(jié)核菌中含KatG-315突變體。此突變體可保護結(jié)核菌不被異煙肼殺滅，使結(jié)核菌毒力增強，應(yīng)用此方法可檢出耐藥菌，提高藥敏試驗敏感性。Yzquierdo等［30］應(yīng)用PCR方法循環(huán)擴增Hsp65基因片段，再用RFLP消化此基因片段，檢測是否存在結(jié)核桿菌感染。該檢測方法檢測的關(guān)鍵在于內(nèi)切酶和引物的選擇［31］。

3.5 基因芯片技術(shù)(Gene Chips) 基因芯片是，以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將三種抗原18 kDa、16 kDa、LAM固定于同一膜片上，利用微孔濾膜的滲透、濃集作用，抗原抗體在固相膜上快速反應(yīng)，生成免疫復(fù)合物，用免疫金作標(biāo)記，待膜顯色，把顯色的芯片進行不通抗原點陣灰度值分析，檢測出結(jié)核分枝桿菌。應(yīng)用高密度寡核苷酸序列通過利用rpoB基因的保守片段與探針基因芯片雜交，進行了耐利福平突變基因rpoB的檢測。第一塊結(jié)核病的基因芯片，包括2部分，其中一部分用于耐利福平菌株中rpoB基因的檢測，部分是在結(jié)核分枝桿菌有種間多態(tài)性的16SrRNA基因片段，可鑒別結(jié)核分支和非分枝桿菌?；蛐酒瑱z測法最大的優(yōu)勢在于能夠同時分析成千上萬個基因。進一步利用DNA芯片分別檢測耐異煙肼菌株和耐利福平菌株，敏感度分別為95%和80%。段慧萍等［32］應(yīng)用結(jié)核蛋白芯片檢測 18 kDa、16 kDa、LAM 三種結(jié)核抗體，三種抗體聯(lián)合檢測對于結(jié)核菌感染血清學(xué)診斷有很高靈敏度和特異性結(jié)果有芯片閱讀儀完成，避免認(rèn)為主觀誤差的優(yōu)點?；蛐酒诮Y(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性監(jiān)測、基因組比較分析等方面發(fā)揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高等因素，限制了其在基層單位的應(yīng)用。

綜上所述，近年來結(jié)核病的實驗室診斷在多方面有了很大的進展，但由于結(jié)核桿菌變異較大，且具有多樣性，同時由于應(yīng)用抗結(jié)核藥物的不規(guī)范性，不能足量足療程正規(guī)治療，出現(xiàn)多種耐藥菌，耐多藥菌株，單一方法往往不能鑒定出所有結(jié)核桿菌，需多種方法聯(lián)合。多種實驗診斷技術(shù)由實驗室向臨床應(yīng)用的過度，但仍存在很多問題，比如許多實驗試劑設(shè)備價格昂貴，操作復(fù)雜不易在基層推廣使用。但是分子生物學(xué)技術(shù)隨著基因診斷發(fā)展，對結(jié)核桿菌遺傳信息的不斷發(fā)展，為快速診斷結(jié)核分枝桿菌提供了更快捷、更敏感的手段，在診斷技術(shù)領(lǐng)域擁有巨大的潛力，隨著技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核病的診斷也將不斷完善和發(fā)展。

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