哺乳動物精原干細(xì)胞研究進(jìn)展及應(yīng)用展望

張 煒，任有蛇，張春香

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷030801)

雄性動物性成熟后，睪丸內(nèi)能夠源源不斷地進(jìn)行精子發(fā)生，并形成連續(xù)的精子發(fā)生波產(chǎn)生大量精子。精子發(fā)生(spermatogenes)是精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs) 在相關(guān)因子及信號的調(diào)控下分化增殖產(chǎn)生大量精子的有序而精確的生理過程。因此，精原干細(xì)胞在遺傳信息從體細(xì)胞向單倍體雄性配子傳遞的過程中承擔(dān)著重要的作用［1］。而且精原干細(xì)胞是出生后哺乳動物體內(nèi)唯一能夠?qū)⑵渥陨淼倪z傳物質(zhì)傳遞給后代的細(xì)胞類群［2］。作為精子發(fā)生過程中最原始最幼稚的前體細(xì)胞，對于雄性哺乳動物的精子發(fā)生至關(guān)重要。對SSCs 的相關(guān)研究是近年來干細(xì)胞及相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)理論及技術(shù)研究中新興的熱點。

精原干細(xì)胞的鑒定分離及體外培養(yǎng)是進(jìn)行其相關(guān)研究的重要手段。但精原干細(xì)胞本身的一些缺點，如在成體睪丸內(nèi)所占的比例極低，而且對SSCs 的表面和相關(guān)分子標(biāo)記的研究還不是非常明確。因此，對雄性動物生殖干細(xì)胞更加深入的研究和應(yīng)用仍然存在許多技術(shù)難點。近年來，隨著細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)、移植技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，人們已經(jīng)能夠高效篩選并富集特定動物的SSCs，同時也為雄性生殖生理研究提供了新的方法和技術(shù)［3］。本文闡述了精原干細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特征、增殖及分化相關(guān)的調(diào)控機(jī)理、鑒別的特異性標(biāo)記物等方面的研究進(jìn)展，同時討論了SSCs 在動物繁殖技術(shù)與生殖臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用前景。

1 哺乳動物精原干細(xì)胞的生物學(xué)特點

1.1 精原干細(xì)胞的來源及形態(tài)學(xué)特征

精原干細(xì)胞存在于雄性哺乳動物精子發(fā)生的場所——睪丸，位于曲細(xì)精管基底膜，朝向曲細(xì)精管管腔的一側(cè)有賽托利細(xì)胞(sertoli cell) 覆蓋。精原干細(xì)胞的前體細(xì)胞是起源于胚胎外胚層的原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs) ，PGCs 自尿囊基部沿后腸遷移至胚胎兩側(cè)的生殖嵴并被賽托利細(xì)胞的前體細(xì)胞包圍，之后與賽托利細(xì)胞一并形成生殖索。之后原始生殖細(xì)胞發(fā)育為精母細(xì)胞，待個體性成熟后通過各級分化最終產(chǎn)生具有生殖功能的精子［4］。SSCs 較睪丸內(nèi)的其他體細(xì)胞個體大，形態(tài)通常近似為圓形或橢圓形，細(xì)胞核較大，核仁常位于細(xì)胞核的中央; 除線粒體與核糖體含量較高外，胞質(zhì)中的其余細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，細(xì)胞間有間橋連接。人與小鼠的精原干細(xì)胞直徑為10～12 μm，豬為20 ～25 μm。SSCs 生長狀態(tài)良好時可見胞質(zhì)透明，顆粒較少，細(xì)胞核不明顯，且常見2 個或多個精原干細(xì)胞［5］。

1.2 精原干細(xì)胞在精子發(fā)生過程中的變化及相關(guān)特征

根據(jù)核仁在細(xì)胞核中的位置及染色質(zhì)的形態(tài)，一般可以將精原細(xì)胞分為A、B 兩型，A 型精原細(xì)胞細(xì)胞核中核仁?？拷四?，在每個曲細(xì)精管的橫斷面一般有7 ～8 個A 型精原細(xì)胞，細(xì)胞直徑為9 ～10 μm，細(xì)胞核直徑大約為6.5 ～7.5 μm，核內(nèi)多均值染色質(zhì)，染色質(zhì)較小; B 型精原細(xì)胞核仁位于細(xì)胞核的中央，染色質(zhì)較A 型精原細(xì)胞粗大。在精子發(fā)生過程中，A 型精原細(xì)胞通過不斷地分裂增殖，一部分保留為A 型精原細(xì)胞且保留干細(xì)胞的特征; 另一部分則轉(zhuǎn)化為B 型精原細(xì)胞，進(jìn)而繼續(xù)分化為各級精母細(xì)胞并最終形成精子。根據(jù)A 型精原細(xì)胞在曲細(xì)精管及賽托利細(xì)胞上的局部排列特征，又可將其分為單個型A-single(As) 、對稱型A-paired(Apr) 及鏈狀排列型A-aligned(Aal)三種類型。通常認(rèn)為，在非靈長類動物，真正的精原干細(xì)胞實際上是As(A single) 型精原細(xì)胞。As 精原細(xì)胞能夠通過自我更新或不對稱分化產(chǎn)生子代細(xì)胞，這些子代細(xì)胞通過細(xì)胞間橋相互連接形成Apr 型雙細(xì)胞體，Apr 細(xì)胞對進(jìn)一步分化產(chǎn)生Aal 型線狀細(xì)胞群體［6，7］。Aal 型細(xì)胞群體進(jìn)一步分化成A1型精原細(xì)胞，再經(jīng)6 次有絲分裂形成A2、A3、A4、In 和B 型精原細(xì)胞［8］。

1.3 精原干細(xì)胞在動物體內(nèi)存在的微環(huán)境

精原干細(xì)胞(SSCs) 位于動物睪丸的生精上皮基底部，數(shù)量很少，僅占精原細(xì)胞的0.03 %左右。最近的研究表明，干細(xì)胞在有機(jī)體內(nèi)生存定居并依賴其發(fā)揮生理功能的特異性細(xì)胞外環(huán)境稱為“龕”［9］。在精原干細(xì)胞的龕內(nèi)不僅有SSCs，還存在著SSCs 的前體細(xì)胞，這些前體細(xì)胞有人將其稱為祖細(xì)胞。有研究表明，SSCs 龕境的結(jié)構(gòu)及生理特征對龕境內(nèi)的SSCs 及其前體細(xì)胞有最直接的影響［10］。在雄性哺乳動物的睪丸內(nèi)，以賽托利細(xì)胞、曲細(xì)精管周圍的肌樣細(xì)胞及基膜圍繞所形成的框架構(gòu)成了精原干細(xì)胞的龕境。而部分學(xué)者僅將睪丸中存在SSCs 的曲細(xì)精管定義為SSCs 的龕境［11］。位于龕境中的SSCs 可以保持其特定的可塑性，SSCs 一旦離開龕境，就會失去其自身特有的自我更新能力而啟動向各級精原細(xì)胞的分化程序，SSCs 經(jīng)分化最終形成具有正常功能的精子［12］。精原細(xì)胞能夠在曲細(xì)精管中增殖、分化，表明是SSCs 龕境真正的劃界位置在曲細(xì)精管的基底膜。因此，區(qū)分基底膜及其相關(guān)的分子標(biāo)記，是對精原干細(xì)胞進(jìn)行定位、鑒定和收集的一種重要手段［11］。

曲細(xì)精管周圍的環(huán)境是由許多具有不同生理功能的細(xì)胞所構(gòu)成的間質(zhì)組織包繞組成的，這樣的環(huán)境可以為精原干細(xì)胞的自我增殖及精子發(fā)生過程提供所需的激素及各種生理活性因子。有研究者將小鼠睪丸的支持細(xì)胞分離制成細(xì)胞懸液并將其注入到不育小鼠受體的曲細(xì)精管內(nèi)，一段時間后，可以檢測到受體小鼠重新生成了具有正常功能的精子并使雌性成功受孕。以上研究表明，睪丸中的支持細(xì)胞不僅構(gòu)成了SSCs 龕境的基本框架，而且對精原干細(xì)胞的增殖、分化及正常生理功能的發(fā)揮和精子發(fā)生過程起著不可替代的維持與調(diào)控作用。因此，精子發(fā)生過程依賴于SSCs 的特異性生理功能，而SSCs 正常生理功能的發(fā)揮除了受自身基因特異性表達(dá)調(diào)控的作用外，還受其所處龕境的直接或間接的調(diào)節(jié)［13］。

2 精原干細(xì)胞自我更新與分化的相關(guān)分子機(jī)制

SSCs 在哺乳動物體內(nèi)的自我更新、增殖、分化及發(fā)育過程不僅受到自身基因特異性表達(dá)調(diào)控的影響，還受SSCs 所處內(nèi)環(huán)境的影響。同時，賽托利細(xì)胞管周肌樣細(xì)胞Leydig 細(xì)胞及SSCs 本身所分泌的眾多生長因子和其他相關(guān)調(diào)節(jié)因子都直接或間接地參與SSCs 的各項生理活動。

2.1 存在于精原干細(xì)胞微環(huán)境——龕中的相關(guān)因子

隨著膠質(zhì)神經(jīng)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)的發(fā)現(xiàn)，對哺乳動物SSCs 微環(huán)境——龕調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究及理解取得了重大進(jìn)展。GDNF 是轉(zhuǎn)化生長因子- β(transforming growth factor-β，TGF-β) 家族的一個成員，能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元分化并維持其存活［14～17］，同時也是一種具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞株及細(xì)胞系發(fā)育和分化的多功能信號分子。GDNF 由賽托利細(xì)胞產(chǎn)生，是目前唯一所知在調(diào)控SSCs 自我更新與增殖過程中起重要作用的旁分泌類型的生長因子［18］。Tadokoro及其同事2002年證明，Sertoli 細(xì)胞表達(dá)GDNF 依賴于促卵泡素(FSH)［19］。SSCs 在GDNF 的刺激下，能夠表達(dá)Gfrα-1 和C-Ret 等GDNF 受體。近期的研究結(jié)果表明，Akt 信號通路和Src 蛋白激酶家族(SFK) 信號通路均對GDNF 與SSCs 的相互作用發(fā)揮調(diào)控作用。Akt 信號通路促進(jìn)SSCs 的均等分裂而導(dǎo)致自我更新，而GDNF 通過SFK 信號通路上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Bcl6b(B cell CLL/lymphoma 6，member B) 、Etv5(Ets variant gene 5) 與Lhx1(Lim homeobox protein 1) 而間接調(diào)控SSCs 生理功能的正常發(fā)揮，這些轉(zhuǎn)錄因子對SSCs 在體外的存活及維持也有重要作用。

Sertoli 細(xì)胞分泌的其他生長因子對SSCs的增殖和自我更新也是必需的［20］，堿性成纖維生長因子(bFGF or FGF2) 和表皮生長因子(EGF) 就是其中最重要的兩類。Apert 綜合癥引起的先天畸形是父系遺傳疾病，雄性個體隨著年齡的增加而越來越難以生育子代。這一疾病是由于FGF2 受體基因(FGFR2) 發(fā)生突變而導(dǎo)致FGF 的功能發(fā)生改變。有資料表明，父系的一個SSC 發(fā)生突變之后，較其他SSCs 更具有自我更新的優(yōu)勢，從而出現(xiàn)越來越多的突變型SSCs 子代，隨著年齡的增長導(dǎo)致越來越多的突變型精子，且這些精子大多沒有正常的生殖能力。由此可見，F(xiàn)GFR2 確實在SSC 細(xì)胞系中表達(dá)，這表明SSCs 中FGFR2 下游的分子信號通路也參與了調(diào)節(jié)SSC 的分化與自我更新。此外，F(xiàn)GF2也刺激了Sertoli 細(xì)胞產(chǎn)生GDNF，間接調(diào)控SSCs 的活動［21］。

Sertoli 細(xì)胞中含有卵泡刺激素和睪丸酮受體，而卵泡刺激素與睪丸酮是精子發(fā)生的主要激素調(diào)節(jié)因子。精子發(fā)生的激素調(diào)節(jié)包括對Sertoli 細(xì)胞的成熟和支持活性的調(diào)節(jié)，故Sertoli 細(xì)胞對于協(xié)調(diào)精子發(fā)生過程至關(guān)重要，其功能損傷對精子形成及精原細(xì)胞都將產(chǎn)生嚴(yán)重后果［22］。Sertoli 細(xì)胞還可以分泌一種能與雄性激素結(jié)合的蛋白質(zhì)，即雄激素結(jié)合蛋 白(androgen- binding protoin，ABP) ，使雄性激素在近管腔側(cè)維持較高濃度，形成特殊的微環(huán)境，以利于生精細(xì)胞正常分化和發(fā)育。

2.2 SSCs 分泌的能夠促進(jìn)自我更新的轉(zhuǎn)錄因子

擁有l(wèi)uxoid 自發(fā)突變型的小鼠睪丸內(nèi)會出現(xiàn)SSCs 嚴(yán)重缺失的現(xiàn)象。Buaas 等人通過研究發(fā)現(xiàn)，前髓細(xì)胞性白血病鋅指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger protein，Plzf; ZBTB16) 是luxoid 突變體中的斷裂基因［23］。這項發(fā)現(xiàn)表明，此基因在對SSCs 的自我更新和分化的調(diào)節(jié)過程中扮演著重要的角色。As，Apr，Aal 型精原細(xì)胞都表達(dá)Plzf蛋白。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Plzf 直接抑制c-Kit 受體在早期精原細(xì)胞中的表達(dá)［24］。c-Kit 受體從后期的Aal 精原細(xì)胞開始表達(dá)，在被它的配體干細(xì)胞因子(Stem cell factor，SCF) 激活之后，c-Kit 對于從Aal 型精原細(xì)胞到A1 型精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程非常重要［25，26］?？?見，Plzf通過抑制As、Apr 和Aal 型精原細(xì)胞中c-Kit 的表達(dá)而阻止它們向A1 型細(xì)胞的分化。

另一個在SSCs 維持中很重要的轉(zhuǎn)錄因子是TATA 框結(jié)合蛋白相關(guān)因子4b(TATA box- binding protein- associated factor 4b，Taf4b) ，表達(dá)于哺乳動物的SSCs 和精母細(xì)胞。敲除Taf4b 基因的小鼠，隨著年齡的增長，睪丸中SSCs 的數(shù)量逐漸下降，最終喪失精子發(fā)生能力［27］。

Oatley 等兩次研究發(fā)現(xiàn)，存在另外一種與Plzf 同家族的鋅指蛋白-Bcl6b，其也能抑制SSCs 的分化，并且這一過程受GDNF 的調(diào)控［28，29］。Oatley 等研究發(fā)現(xiàn)，兩種新的轉(zhuǎn)錄因子-Etv5 和Lhx1 通過調(diào)控GDNF 的表達(dá)來間接調(diào)控SSCs的活性［28～31］。此 外，Etv5 也被發(fā)現(xiàn)在Sertoli 細(xì)胞中表達(dá)，而Etv5在Sertoli 細(xì)胞和SSCs 的表達(dá)規(guī)律還有待研究。但是，通過干擾Sertoli 細(xì)胞的功能或直接作用于SSCs 下調(diào)Etv5 基因的表達(dá)或敲除小鼠etv5 基因后，均表現(xiàn)出SSCs 數(shù)量減少的趨勢。因此，Etv5 對于SSCs 的維持可能起非常重要的作用［32，33］。

3 哺乳動物精原干細(xì)胞的鑒定分選及相關(guān)分子標(biāo)記研究

3.1 哺乳動物精原干細(xì)胞鑒定分選方法

精原干細(xì)胞的識別與鑒定可依據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和在生精上皮周期中的局部排列位置來進(jìn)行，但因?qū)SCs 表面特異性分子標(biāo)記的研究不夠充分，對于離體、分散的精原干細(xì)胞的識別仍是有待解決的難題之一。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，我們可以從位于精原干細(xì)胞龕境中的細(xì)胞群中分辨出A 型、In 型和B 型精原細(xì)胞，但不能區(qū)別A 型之內(nèi)的一些細(xì)胞類型。對于離體的SSCs 細(xì)胞，我們一般將其制成懸液，用免疫標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)或免疫磁珠法進(jìn)行分選。

當(dāng)需要在體外對SSCs 的行為和特性進(jìn)行進(jìn)一步的研究時，第一步便是分離純化這些具有自我更新與分化能力的細(xì)胞。因SSCs在動物性成熟后會分化出大量的精原細(xì)胞及各級精母細(xì)胞，使得SSCs 的鑒別及分選更為困難。因此，在從動物睪丸內(nèi)獲取細(xì)胞時，一般盡量采用剛出生或出生后不久的個體，以期獲得沒有發(fā)生分化的高純度SSCs細(xì)胞群。從新生動物的睪丸內(nèi)獲得較為理想純度SSCs 細(xì)胞群的方法大致為: 通過使睪丸局部升溫或通過外科手術(shù)將睪丸置于腹腔中建立隱睪動物模型，或通過藥物注射使SSCs 的分化過程受到抑制，但同時對SSCs的自我增殖沒有影響，達(dá)到提高睪丸中SSCs比例的目的，從而提高SSCs 分選的純度和效果［34，35］。以小鼠為試驗動物開展相關(guān)研究大多采用對細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀分選的方法。相關(guān)的技術(shù)及方法在小鼠上的研究已較為深入，而在其他動物，尤其是豬、牛、羊這類經(jīng)濟(jì)型家畜上，更多采用較為簡單的方法，如重力沉降法、Pecoll 法密度梯度分選法，貼壁差速分選法等。

對精原干細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分選，不僅需要在相關(guān)的技術(shù)上不斷改進(jìn)，而且更需要對精原干細(xì)胞的相關(guān)特異性分子標(biāo)記進(jìn)行深入的研究與開發(fā)，并不斷尋找更加準(zhǔn)確有效特異性更強(qiáng)的分子標(biāo)記。通過以上方式，對精原干細(xì)胞的鑒定篩選必定會越來越準(zhǔn)確快捷，為開展SSCs 的深入研究提供科學(xué)合理的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

3.2 哺乳動物精原干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物研究進(jìn)展

SSCs 很難分離，因為SSCs 會分化為很多亞型的精原細(xì)胞，且數(shù)量極少。為尋找SSCs 的表面特異性標(biāo)記，研究者通過檢測許多與SSCs 相關(guān)基因的mRNA 和蛋白的表達(dá)情況來進(jìn)行。隨著人們對精原干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物更加深入的研究，已經(jīng)有十幾種相關(guān)分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)，在已知分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上設(shè)計特定的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，是目前鑒定檢測SSCs 比較普遍的方法。

3.2.1 CD9 CD9 是由227 個氨基酸組成的貫通細(xì)胞膜的Ⅱ型糖蛋白，屬于te-traspans超家族，且在不同類型干細(xì)胞的表面普遍表達(dá)。Kanatsu-Shinohara 等通過檢測SSCs 的細(xì)胞外蛋白，發(fā)現(xiàn)通過篩選位于曲細(xì)精管的基底膜上和間質(zhì)組織中CD9 的陽性表達(dá)可以檢測大鼠和小鼠的SSCs。采用這種方法富集到的SSCs 的量較傳統(tǒng)方法提高5 ～7 倍［36］。

3.2.2 C-kit 受體 C-kit 是HZ4 貓科肉瘤病毒kit 原癌基因的同源物，稱kit 細(xì)胞癌基因，因其表達(dá)產(chǎn)物能與干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合而激發(fā)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的C-kit/SCF信號通路［37］，所以C-kit 又被稱為干細(xì)胞因子受體。C-kit 受體表達(dá)于胚胎干細(xì)胞，外周血造血干細(xì)胞及雄性動物的精原干細(xì)胞，在哺乳動物胚胎時期的原始生殖細(xì)胞的遷移分化及出生后精原細(xì)胞的增殖分化等過程中起重要的調(diào)控作用。

3.2.3 階段特異性胚胎抗原-1(SSEA-1)與堿性磷酸酶(ALP) SSEA-1 是存在于胚胎瘤細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及部分物種胎兒的原始生殖細(xì)胞中的一種與細(xì)胞遷移分化及表面信息交換有關(guān)的多糖基表位抗原［38，39］。SSEA-1 在小鼠胚胎時期即表達(dá)于原始生殖細(xì)胞的表面，個體出生后在成體組織中同樣有不同程度的表達(dá)。但隨著動物體年齡的增長及不斷發(fā)育，從SSEA-1 陽性表達(dá)細(xì)胞群中檢測出精原干細(xì)胞的比率逐漸降低［40］，所以應(yīng)盡早進(jìn)行相關(guān)鑒定及分選。盡管如此，SSEA-1 仍然在精原干細(xì)胞的鑒定分選中不失為一種特異性的鑒定標(biāo)記物。

ALP 是廣泛分布于動物體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織，能夠催化核酸分子脫掉5'磷酸基團(tuán)的一種酶。在臨床醫(yī)學(xué)上，ALP 是用來對生殖細(xì)胞腫瘤和睪丸原位癌進(jìn)行病理學(xué)診斷的傳統(tǒng)標(biāo)志物，同時亦可用于對胚胎干細(xì)胞及精原干細(xì)胞的鑒定分選［41］。采用ALP 為標(biāo)記物對SSCs 進(jìn)行鑒別，最經(jīng)典的方法是顯微鏡下觀察經(jīng)ALP 染色的細(xì)胞群，若視野中有細(xì)胞僅存活于細(xì)胞間橋且細(xì)胞群落呈團(tuán)狀或鏈狀，這樣的細(xì)胞便可認(rèn)定為As 型精原細(xì)胞(SSCs) 。

3.2.4 胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白-4(octamer-4，Oct- 4) 及生殖細(xì)胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF) Oct-4 是胚胎干細(xì)胞發(fā)育與分化過程中的一種很重要的標(biāo)志物，屬于Pit-Oct-Unc(POU) 轉(zhuǎn)錄因子家族，由POU5F1 基因(定位于染色體6p21.3)編碼產(chǎn)生［42］。有研究表明，Oct-4 是特異性非常強(qiáng)的干細(xì)胞標(biāo)志物，其在胚胎樣干細(xì)胞及原始生殖細(xì)胞高度表達(dá)，但在已經(jīng)發(fā)生分化的組織中表達(dá)量有所降低甚至不表達(dá)，這表明Oct-4 的表達(dá)參與了對干細(xì)胞分化的相關(guān)調(diào)控與維持［43］。Oct-4 作為干細(xì)胞的標(biāo)志物，是維持細(xì)胞全能性及部分多能性的轉(zhuǎn)錄因子，在成年動物睪丸內(nèi)的精原干細(xì)胞有表達(dá)［44］。

GCNF 屬于核受體超家族成員。體內(nèi)外研究表明，Oct-4 作為轉(zhuǎn)錄因子受GCNF 的調(diào)控。近期的研究證實，小鼠出生后第8 天開始在睪丸內(nèi)的精原細(xì)胞有GCNF 的表達(dá);但在第17 天后的檢測中發(fā)現(xiàn)，精原細(xì)胞的GCNF 檢測結(jié)果呈陰性，大量的陽性表達(dá)定位于粗線期精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞，此項研究結(jié)果提示，GCNF 對于精子發(fā)生過程的“啟動”可能起到了十分關(guān)鍵的作用［45］。因此，Oct-4 和GCNF 可以作為特異性標(biāo)志，用來對哺乳動物的精原干細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分選。

3.2.5 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNFs) GDNF 對調(diào)控精原干細(xì)胞的增殖及體內(nèi)穩(wěn)定起重要作用，是SSCs 進(jìn)行自我更新和增殖的必須生長因子。因而GNDF 的受體是SSCs 的另外一種重要的表面標(biāo)記物。

4 精原干細(xì)胞的應(yīng)用及前景展望

自Brinster 等1994年通過在睪丸網(wǎng)對小鼠進(jìn)行精原干細(xì)胞異體移植并成功獲得精子［46，47］以來，精原干細(xì)胞在基礎(chǔ)生理學(xué)、動物繁殖學(xué)、臨床生殖醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域巨大的應(yīng)用前景開始受到學(xué)者們的高度重視。近年來，隨著相關(guān)生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)手段的不斷進(jìn)步，對精原干細(xì)胞的研究也在不斷深入，并在多方面取得了顯著的成果。相關(guān)研究的深入與新興成果的出現(xiàn)，給精原干細(xì)胞的應(yīng)用提供了堅實的理論依據(jù)與科學(xué)的技術(shù)支持。

SSCs 的應(yīng)用主要有以下幾個方面:

4.1 研究精子發(fā)生及相關(guān)調(diào)控過程

動物及人的精子在體內(nèi)的發(fā)生是以SSCs為起點，受多種環(huán)境因素及信號調(diào)控的復(fù)雜且高度精確有序的過程。目前，精子發(fā)生過程相關(guān)的調(diào)控機(jī)制仍不為人所知，因而需要研究者進(jìn)一步深入研究。隨著SSCs 體外培養(yǎng)及異源移植技術(shù)的發(fā)展，為研究精子發(fā)生過程提供了新的思路和途徑。結(jié)合細(xì)胞示蹤技術(shù)，對SSCs 表面的特異性標(biāo)記物處理后進(jìn)行移植，可以對供體精原干細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)所發(fā)生的一系列變化及與其相互作用的微環(huán)境進(jìn)行實時全程監(jiān)控，為研究精子發(fā)生及調(diào)控機(jī)制提供幫助。

4.2 轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)都離不開胚胎操作，在操作過程中胚胎會不可避免地遭受損傷，易導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)效率低，生長發(fā)育不正常等現(xiàn)象。1994年，Brinster 等對小鼠的精原干細(xì)胞進(jìn)行異體移植獲得成功，實現(xiàn)了供體的精原干細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)進(jìn)行精子發(fā)生的過程。干細(xì)胞在體內(nèi)增殖分化的效率較高，一個精原干細(xì)胞經(jīng)各級分化最終可以產(chǎn)生4 096 個精子，雖然細(xì)胞凋亡會使精子損失75% ～90%，但理論上一個精原干細(xì)胞最終可產(chǎn)生400 ～1000 個精子，較胚胎容易獲得且成本較低。精原干細(xì)胞研究的不斷深入給轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)提供了全新的空間，用結(jié)合了載體、外源基因與標(biāo)記基因的重組體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞，使目的基因整合到精原干細(xì)胞的基因組，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)后注入到受體動物的睪丸，使其產(chǎn)生含有目的基因的精子。通過特定的手段將含有外源基因的精子分選出來，并用其進(jìn)行人工授精以獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。

4.3 保存、重建生殖能力及治療雄性不育

當(dāng)今，癌癥已經(jīng)成為困擾人類的頭號健康殺手，化療會對患者造成某些生理機(jī)能的損傷，如生殖能力的損傷。接受過化療的年輕男性患者，其自身的精子發(fā)生能力會遭到不可逆轉(zhuǎn)的破壞而導(dǎo)致不育。隨著SSCs 冷凍及移植技術(shù)的發(fā)展，可以在對患者進(jìn)行治療之前提取、分離SSCs 并進(jìn)行冷凍保存及培養(yǎng)，待治療結(jié)束時機(jī)適合時，再將其解凍移植回患者睪丸內(nèi)。有些大動物(如牛) 在同種異體移植實驗中發(fā)現(xiàn)對植入的精原干細(xì)胞有免疫排斥［49］，但也不乏成功的例子，給男性不育的治療提供了新的思路和技術(shù)。

4.4 遺傳疾病的診斷與治療

精原干細(xì)胞是動物體內(nèi)唯一可以將遺傳物質(zhì)傳遞給自身后代的成體干細(xì)胞，其細(xì)胞表面的標(biāo)志物、SSCs 特異性相關(guān)分子標(biāo)記與后代的某些疾病存在相關(guān)性，通過對這類標(biāo)記信號的篩選，可以及早對相關(guān)疾病進(jìn)行診斷。對于存在致病因素的情況，可以對SSCs內(nèi)的遺傳缺陷進(jìn)行修正后擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞株，將修改后的遺傳信息固定后，再移植到種畜或存在家族遺傳疾病患者的睪丸內(nèi)以產(chǎn)生不含遺傳缺陷的精子并產(chǎn)生正常的后代，從而達(dá)到對某些家族遺傳病的治療和遺傳缺陷的矯正。

綜上所述，現(xiàn)今學(xué)術(shù)界對精原干細(xì)胞的相關(guān)研究日趨成熟，但仍有許多未知等待著

我們?nèi)パ芯?、發(fā)現(xiàn)并揭示現(xiàn)象背后更深層次的機(jī)理。隨著各項研究工作的深入與技術(shù)的進(jìn)步，精原干細(xì)胞的應(yīng)用將更加科學(xué)、更加廣泛，在動物繁殖新技術(shù)、生殖生理研究和臨床醫(yī)學(xué)及瀕危物種種質(zhì)資源保護(hù)方面具有廣闊應(yīng)用前景。今后，精原干細(xì)胞在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域必將發(fā)揮重要且不可替代的作用。

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