5-氨基酮戊酸光動力學(xué)療法在體外對紅色毛癬菌的抑制作用研究

梁 義，盧麗明，陳 勇，尹 琦

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科，廣西 柳州 545007）

5-氨基酮戊酸光動力學(xué)療法在體外對紅色毛癬菌的抑制作用研究

梁 義，盧麗明，陳 勇，尹 琦

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科，廣西 柳州 545007）

目的評估以5-氨基酮戊酸為光敏劑的光動力療法在體外對紅色毛癬菌的抑制作用。方法以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為實(shí)驗載體，加入紅色毛癬菌懸液，分為治療組和4個對照組，其中治療組同時給予氦氖激光照射、加入5-氨基酮戊酸、共同避光孵育12 h等三個條件；而4個對照組均不紅色毛癬菌同時具備治療組所獲得的三個條件。然后按照設(shè)定的實(shí)驗條件進(jìn)行5-氨基酮戊酸光動力學(xué)治療，并用噻唑藍(lán)法檢測紅色毛癬菌的存活率。結(jié)果5-氨基酮戊酸的濃度介于0.05%～2.5%之間時，治療組紅色毛癬菌的存活率依次遞減，對應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，存活率對5-氨基酮戊酸的濃度呈劑量依賴關(guān)系。而當(dāng)5-氨基酮戊酸濃度介于2.5%～10%時，治療組紅色毛癬菌的存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，當(dāng)5-氨基酮戊酸的濃度介于0.05%～10%之間時，對照組中紅色毛癬菌的存活率未受影響，四組的紅色毛癬菌的存活率變化無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論在特定濃度下，5-氨基酮戊酸光動力學(xué)療法對紅色毛癬菌有明顯的抑制作用。

5-氨基酮戊酸；光動力療法；紅色毛癬菌；抑制

我國南方地區(qū)溫暖潮濕，特別適合各類致病性真菌的生長，因此皮膚真菌感染成為該地區(qū)最為常見的皮膚感染之一。皮膚真菌感染如果未得到徹底治療，在特殊人群中(老年人和免疫力低下者)易發(fā)展為系統(tǒng)性真菌感染，帶來更嚴(yán)重的危害[1]。現(xiàn)有治療皮膚真菌感染的方法為口服或外用抗真菌藥物，但均對肝腎有一定的毒副作用，因此皮膚科領(lǐng)域急需一種簡單易行，毒副作用更少的新療法。以5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acdi，5-ALA)為光敏劑的光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是近年興起的一種新型治療方法，已被大量用于治療皮膚的各種良惡性腫瘤，如鱗狀細(xì)胞癌、光化性角化病和基底細(xì)胞癌，以及病毒疣等，同時5-ALA-PDT已被證實(shí)能夠殺滅真菌和細(xì)菌[2-4]。在各類致病性真菌之中，紅色毛癬菌是最重要和常見的病原菌之一。本實(shí)驗將評估ALA-PDT在體外抑制或殺滅紅色毛癬菌的效果，為下一步將5-ALA-PDT用于治療由紅色毛癬菌感染所致的皮膚真菌感染提供實(shí)驗室依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗科真菌室提供；5-氨基酮戊酸鹽酸鹽(ALA)由上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司提供。臨用前以二甲基亞砜(DMSO)配制成20%的ALA溶液備用。噻唑藍(lán)(MTT)、PBS緩沖液、RPMI1640液體培養(yǎng)基、沙堡氏培養(yǎng)基由Gibico公司提供。

1.2 主要儀器 HJZ-3型氦氖激光治療機(jī)，波長為632.8 nm，輸出功率為37 mW，由成都國雄光電技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法 參照梁義等[5]的方法進(jìn)行。

1.3.1 紅色毛癬菌懸液的制備 將紅色毛癬菌在新鮮配制的沙堡氏培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種兩次，30℃培養(yǎng)，24 h后，取生長良好的菌落5個，用滅菌生理鹽水制成懸液。通過血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整含菌量，使菌懸液含菌量為1×106CFU/ml(集落形成單位，Colony forming units)。需進(jìn)行MTT檢測時將菌懸液接種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl。

1.3.2 紅色毛癬菌的分組 將紅色毛癬菌分成：(1)治療組：往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入不同量的ALA溶液，使每孔的ALA的終末濃度分別為10%、5%、2.5%、1.25%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%、0.05%。每個濃度的ALA分別加入12個培養(yǎng)孔，并于35℃避光孵育12 h。(2)4個對照組：a：單純的紅色毛癬菌懸浮液，無ALA-PDT處理；b：紅色毛癬菌懸浮液加入不同濃度的ALA共同孵育，無激光照射；c：紅色毛癬菌懸浮液未加入ALA，只予激光照射；d：紅色毛癬菌懸浮液加入不同濃度的ALA后立即予激光照射。每組12孔細(xì)胞，除d組外均于35℃避光孵育12 h。

1.3.3 氦氖激光照射 用光導(dǎo)纖維把激光引到培養(yǎng)孔上方，激光頭與培養(yǎng)板的垂直距離為0.5 cm，使光斑直徑為0.32 cm，剛好能覆蓋培養(yǎng)孔上口，照射的能量密度為55 J/cm2。按此方法對治療組和對照組中的c組、d組進(jìn)行照射。

1.3.4 MTT法檢測紅色毛癬菌的存活率 將上述經(jīng)過處理的治療組和4個對照組的紅色毛癬菌放入濕盒內(nèi)，35℃避光孵育后進(jìn)行MTT檢測，具體操作按照說明書進(jìn)行。為確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，以上研究步驟重復(fù)三次。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，多組間多樣本均數(shù)比較行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組a存活率為(96.1±2.4)%，對照組b存活率為(92.1±3.3)%，對照組c存活率為(97.1±1.2)%，對照組d存活率為(93.1±6.1)%，四者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明對照組中紅色毛癬菌的活性未受到明顯抑制。治療組中，當(dāng)ALA濃度分別為0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%、5%和10%時，經(jīng)過PDT處理后，用MTT法檢測紅色毛癬菌的存活率分別為(86.1±3.3)%、(78.3±2.5)%、(69.7±1.7)%、(61.7±4.3)%、(48.9±5.1)%、(36.5±4.6)%、32.4±6.2)%、(30.6±3.2)%和(28.9±5.4)%。對以上存活率進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ALA濃度分別為0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%時，對應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而當(dāng)ALA濃度分別為2.5%、5%、10%時，其對應(yīng)的存活率之間進(jìn)行兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明當(dāng)ALA濃度從0.05%遞增至2.5%時，紅色毛癬菌的存活率依次遞減，存活率對ALA的濃度呈劑量依賴關(guān)系，而當(dāng)ALA濃度位于2.5%～10%時，紅色毛癬菌的存活率無明顯差異。

3 討論

紅色毛癬菌是導(dǎo)致皮膚真菌病的主要病原菌之一，在地域上多發(fā)生于濕熱的南方地區(qū)；好發(fā)人群為老年人或伴有糖尿病、腎病、惡性腫瘤等內(nèi)科疾病者。目前治療皮膚真菌病主要采用局部外用或系統(tǒng)使用抗真菌藥物的方法，但均難以防止復(fù)發(fā)。系統(tǒng)使用抗真菌藥物治療皮膚真菌病周期長，費(fèi)用高，對肝腎有一定的毒副作用，更易導(dǎo)致真菌產(chǎn)生耐藥性；這些局限性制約了該方法在上述好發(fā)人群中的應(yīng)用。ALA-PDT已被廣泛用于臨床治療皮膚腫瘤，療效肯定，副作用少。本實(shí)驗旨在評估ALA-PDT在體外對紅色毛癬菌活性的抑制效應(yīng)，為將來使用ALA-PDT療法在臨床上治療皮膚真菌病提供實(shí)驗依據(jù)。

光敏劑、激發(fā)光是ALA-PDT的基本要素，ALA是目前應(yīng)用最為廣泛的、可以局部外用的光敏劑。國內(nèi)外在體外進(jìn)行ALA-PDT抑制紅色毛癬菌活性的研究中，所獲得的研究結(jié)果差異很大，但普遍認(rèn)為ALA-PDT能不同程度殺滅或抑制紅色毛癬菌。但對ALA的濃度、使用何種化學(xué)試劑作為ALA的穿透促進(jìn)劑、ALA與紅色毛癬菌共同孵育的時間均有不同看法；通過多次預(yù)實(shí)驗和摸索，本實(shí)驗的治療組采用ALA的濃度介于0.05%～10%之間，采用DMSO作為ALA的穿透促進(jìn)劑[6-7]，ALA與紅色毛癬菌共同孵育的時間為12 h。結(jié)果表明，ALA的濃度介于0.05%～2.5%之間時，經(jīng)過與ALA共同孵育12 h后再進(jìn)行PDT，紅色毛癬菌的存活率依次遞減，存活率對ALA的濃度呈劑量依賴關(guān)系。而當(dāng)ALA濃度介于2.5%～10%時，紅色毛癬菌的存活率無明顯差異。本實(shí)驗的對照組中紅色毛癬菌的存活率未受到影響，說明單純激光和只加ALA無激光光照，或紅色毛癬菌懸浮液加入ALA后，孵育時間不足，均對紅色毛癬菌的存活率無明顯的影響。因為對照組不能同時具備光敏劑、激發(fā)光基本要素，因此不能引發(fā)ALA-PDT的治療作用，其充分說明本實(shí)驗采用的方案是合理、有效的。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)ALA必須與紅色毛癬菌共同孵育一定時間后才能產(chǎn)生足夠的PpIX。國外研究認(rèn)為不同種類的真菌，孵育的時間也不同；ALA的濃度達(dá)到一定值后，再增高ALA的濃度，PDT并不能提高對真菌的存活率的影響。究其原因，可能與紅色毛癬菌把ALA轉(zhuǎn)化為PpIX的能力以及孵育過程中pH的變化有關(guān)[8-9]。國外研究結(jié)果能夠部分解釋了本實(shí)驗所獲得的成果，但本實(shí)驗的例數(shù)、規(guī)模、各種觀察指標(biāo)和驗證手段仍有待進(jìn)一步的深入研究，才能得出更精確的結(jié)論。

本實(shí)驗證實(shí)，ALA-PDT在體外能有效地抑制紅色毛癬菌，ALA濃度為2.5%時抑制效果最好，可以作為ALA-PDT治療紅色毛癬菌引起的皮膚真菌感染的實(shí)驗依據(jù)。但該療法應(yīng)用于人體的情況如何，仍需做更深入研究，有望成為治療皮膚真菌感染的新方法。

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Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.

LIANG Yi,LU Li-Ming, CHEN Yong,YIN Qi.Liuzhou Railway Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.Methods96-well cell culture plates were used as experimental carriers for adding Trichophyton rubrum suspension,which were divided into experimental group and four control groups.He-Ne laser irradiation, 5-aminolevulinic acid and avoiding light incubation for 12 hours were given in the experimental group at the same time.But four control groups did not received three conditions at the same time.Then ALA-PDT was done under experimental conditions.The survival rate of Trichophyton rubrum was detected by MTT.ResultsWhen the concentration of ALA ranged from 0.05%to 2.5%,the survival rate of Trichophyton rubrum decreased in experimental group(P＜0.05).The survival rate and the concentration of ALA were in a dose-dependent manner.When the concentration of ALA ranged from 2.5%to 10%,there was no significant difference in the survival rate of Trichophyton rubrum(P＞0.05).The survival rate of Trichophyton rubrum in four control groups were not affected,and there was no significant difference(P＞0.05).ConclusionALA-PDT could effectively inhibit the growth of Trichophyton rubrum when ALA is within specific concentration range.

5-aminolevulinic acdi;Photodynamic therapy;Trichophyton rubrum;Inhibition

R379.2+2

A

1003—6350（2014）23—3436—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1346

2014-06-27)

廣西衛(wèi)生廳課題（編號：Z2012552）

梁 義。E-mail：liangyi007030@sina.com