梅毒螺旋體實驗室檢測方法研究進展

王憲靈 王縛鯤

梅毒危害極大，在我國曾一度被消滅，但隨著近年來對外交流的日益頻繁又死灰復(fù)燃，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。2012年國家衛(wèi)生部公布的甲、乙類法定報告?zhèn)魅静≈?，梅毒發(fā)病率較2011年上升3.27%，死亡率上升5.36%，應(yīng)引起重視。因此早期檢出患者，及時治療，控制傳染源，是控制梅毒傳播的重要措施。梅毒檢測方法有多種，現(xiàn)就梅毒螺旋體的實驗室常見的診斷方法作一簡要綜述。

1 病原體的檢測

對患者分泌物進行觀測，如發(fā)現(xiàn)運動的蒼白螺旋體即可確診為梅毒，該方法特異性高，但靈敏度稍低，容易漏檢。梅毒檢測適用于早期梅毒皮膚黏膜損害，對硬下疳尤為重要，因為人體感染TP 3～6周后，才能通過梅毒螺旋體抗原血清試驗(TPHA)、梅毒熒光抗體(FTA)等敏感性、特異性較高的方法檢測到血清中的抗體［1］，在患者血清抗體達到可測水平之前，TP檢查是早期診斷梅毒最好的方法。

1.1 暗視野顯微鏡(DF) 檢查梅毒螺旋體暗視野檢查法是梅毒病原體檢測的主要方法。在皮損處，用玻片刮取組織滲出液或淋巴結(jié)穿刺液，用500×暗視野顯微鏡觀察，在暗背景上，梅毒螺旋體呈白色發(fā)光、運動快速、急促，也可較緩慢地圍繞長軸旋轉(zhuǎn)。根據(jù)其典型的形態(tài)、大小和運動方式，結(jié)合臨床癥狀可直接診斷梅毒。暗視野檢查法特異性高，適用于早期梅毒的診斷。但由于受病程、取材、檢測人員技術(shù)水平以及部分患者不規(guī)則使用抗生素導(dǎo)致TP數(shù)量減少和活動力下降的影響，敏感性較低為54.4%［2］，因此此法檢查陰性也不能排除患梅毒的可能。該法簡單、快速，但不適用于潛伏及晚期梅毒患者。且口腔中可能存在其他螺旋體，因此此法對口腔病灶材料亦不適用。

1.2 活體組織檢查梅毒螺旋體 常用銀染色法(warthin-starry)或直接熒光抗體試驗(DFAT)檢查活體組織梅毒螺旋體。銀染色法能使梅毒螺旋體染成棕褐色或黑褐色，形態(tài)清晰易辯，且標本可以永久保存。但由于存在梅毒螺旋體類似物質(zhì)的干擾，因此，銀染色陽性結(jié)果的判斷應(yīng)慎重。特異性熒光抗體試驗是用非致病性螺旋體培養(yǎng)物對抗梅毒螺旋體抗血清或單克隆抗體吸收后，再與異硫氰酸熒光素(FITC)相結(jié)合，在熒光顯微鏡下判讀結(jié)果。梅毒螺旋體發(fā)特異性黃綠色熒光，靈敏性稍高于暗視野檢查法?？捎糜诿范韭菪w與類似螺旋體的鑒別。

1.3 多功能超高倍顯微診斷儀(MDI) 是一種集光學(xué)、光電學(xué)、電子學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)和多媒體計算機技術(shù)于一體的高科技醫(yī)學(xué)顯微設(shè)備，其具有共軛變焦、高清晰度、高分辨率、高放大倍率的特點，有效放大倍率可達20 000倍以上?？梢钥焖佟⒈憬莸倪M行標本觀測。其在Ⅰ期梅毒診斷的陽性率為83.75%［3］，但由于設(shè)備昂貴難以普及。

2 梅毒血清學(xué)檢查

機體感染梅毒螺旋體后可產(chǎn)生兩種抗體，一種是抗梅毒螺旋體的特異性抗體(IgM和IgG);一種是非梅毒螺旋體特異性的抗體，即反應(yīng)素。梅毒血清學(xué)檢查包括非梅毒螺旋體抗體檢測(非特異性抗體檢測)和特異性梅毒螺旋體抗體檢測。前者敏感性、特異性均較后者低，但由于抽血后1 h即可出結(jié)果，費用也低廉，因此常用于臨床篩選。并且非特異性抗體在治療后下降或消失，因此可判定治療效果。后者敏感性和特異性均較高，主要用于確認試驗，但由于其不隨治療下降或消失，故不能用于判定治療效果。

2.1 非梅毒螺旋體血清試驗 非梅毒螺旋體血清試驗檢測的為非特異性抗體(反應(yīng)素)，某些其他疾病患者如結(jié)核、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、猩紅熱等甚至健康人中也可出現(xiàn)反應(yīng)素，因此可出現(xiàn)生物學(xué)假陽性。此外，標本溶血或容器污染等亦可引起假陽性反應(yīng)，其特異性較低。經(jīng)治療后患者反應(yīng)素可消失或陰轉(zhuǎn)，通常用于療效觀察、判斷復(fù)發(fā)及再感染。

2.1.1 性病研究實驗室試驗(VDRL):以心磷脂、膽固醇及卵磷脂的混懸液作為抗原，與機體產(chǎn)生的反應(yīng)素在體外發(fā)生反應(yīng)。屬于微量玻片法，操作簡單、快速，對診斷神經(jīng)梅毒有重要價值［4］，敏感性可達99%，特異性達70.8%［5］?？勺鞫考岸ㄐ栽囼灒珜σ黄诿范久舾行缘?。

2.1.2 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR):VDRL試驗的改良。用標準活性炭顆粒吸附VDRL抗原，操作簡單、快速，結(jié)果易于觀察，靈敏度較VDRL高，是目前臨床應(yīng)用最多的檢測方法之一。RPR可檢測滴度，滴度可在治療后半年到2年下降4倍，滴度變化是觀察治療效果、復(fù)發(fā)或再感染的重要指標。RPR試驗和DF方法相結(jié)合，可早期診斷梅毒［6］。其缺點是反應(yīng)素水平過高可產(chǎn)生假陰性結(jié)果。該法對神經(jīng)梅毒、潛伏期梅毒不敏感。

2.1.3 不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(USR):為改良的VDRL試驗，待檢血清不需加熱滅活，直接在玻片上進行絮狀反應(yīng)，肉眼判讀結(jié)果。此法敏感性高而特異性較低，易發(fā)生生物學(xué)假陽性，亦可作為療效觀察、判斷復(fù)發(fā)或再感染的指標。

2.1.4 甲苯胺紅不加熱血清實驗(TRUST):其原理是以甲胺苯紅染料顆粒代替炭顆粒作為指示物，當液體中出現(xiàn)凝集程度不同的紅色凝塊時即判為陽性，簡便快速，結(jié)果判讀以白色紙卡為背景，清晰易判，穩(wěn)定性好。對于非梅毒螺旋體特異性抗體的檢測，TRUST法的檢出率和重復(fù)性均優(yōu)于RPR法。但由于在梅毒感染的早期和潛伏期，血清中反應(yīng)素很少，其檢出率亦較低，分別為 72.7%和 73.7%［7］。

2.2 梅毒螺旋體血清試驗 此類試驗采用的抗原是梅毒螺旋體或其成分，檢測血清中的抗梅毒螺旋體IgM和/或IgG抗體，其敏感性和特異性均較高，一般用作確證試驗［8］。但由于特異性IgG抗體可終身存在，因此不能用作療效觀察。

2.2.1 梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA):該法使用甲醛處理的羊紅細胞做抗原載體，吸附從兔睪丸中提取后經(jīng)超聲波粉碎的Nichols株梅毒螺旋體菌體抗原，檢測血清中抗梅毒螺旋體特異性抗體。為排除非特異性反應(yīng)，待測血清需經(jīng)吸收劑(兔睪丸提取物、正常兔血清及超聲處理的密螺旋體無毒株Reiter株)吸收，因此TPHA具有高度的敏感性和特異性，是目前臨床常用的梅毒血清學(xué)確證試驗。其缺點是抗原制備困難，試劑較昂貴，操作較繁瑣，且易發(fā)生自凝現(xiàn)象［9，10］。

2.2.2 梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA):TPPA與TPHA不同的是用明膠顆粒代替羊紅細胞做抗原載體，吸附梅毒螺旋體Nichols株菌體抗原，從而避免了TPHA法血球易自凝而造成的漏診。TPPA敏感度和特異性均較高，分別為 99.2% 和 97.0%［11］，在臨床上亦常用于梅毒血清學(xué)確證試驗。該法操作簡便、快速，結(jié)果易于判斷，但同樣由于試劑價格較昂貴而使其在臨床的大規(guī)模使用受到限制。

2.2.3 熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS):是一種間接熒光抗體法，其先以密螺旋體無毒株(Reiter株)超聲裂解抗原吸收待檢血清，除去具有交叉反應(yīng)的抗體，再與梅毒螺旋體菌體作用，然后加入熒光素標記的抗人IgG。此法敏感性、特異性均較高，文獻報道FTA-ABS對各期梅毒檢測的特異性達到92%，對一期梅毒敏感性為80%，二期為99% ～100%，三期為95%～100%［12］，亦常被用做確證試驗。FTA-ABS-19S-IgM試驗是先將血清中IgG和IgM分離，再用FTA-ABS法檢測19S-IgM抗體，避免了母體IgG的干擾，常用于新生兒先天梅毒血清學(xué)的診斷試驗，是早期確診先天梅毒的重要手段。其缺點在于步驟繁瑣，操作費時，結(jié)果判讀易受操作人員經(jīng)驗的影響。

2.2.4 快速乳膠凝集試驗(syphilis fast test):本試驗是將梅毒螺旋體TpN15、TpN17與TpN47重組抗原結(jié)合到乳膠顆粒上，當血清中存在特異性梅毒螺旋體抗體時，即可發(fā)生凝集反應(yīng)。其與TPPA一致率可達98.8%，有一定的敏感性和特異性。該試驗操作簡單、快速，適合門診梅毒檢測。

2.2.5 梅毒螺旋體免疫印跡技術(shù)(WB):該法將免疫學(xué)的特異性和分子生物學(xué)的靈敏性相結(jié)合，具有敏感性高、特異性強的特點。Byrne等［13］用免疫印跡法檢測梅毒螺旋體抗體時，認為只有當 15.5、17、44.5、47 kDa 4個抗原中的3個被檢測到才能判斷為陽性，其敏感性為98%，特異性為100%。診斷梅毒的靈敏性優(yōu)于FTA-ABS約3～4個血清稀釋度。對神經(jīng)性梅毒檢測的陽性率為100%。此法操作簡便，特異性好，結(jié)果易判，但成本較高。

2.2.6 梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(TP-ELISA):是將梅毒螺旋體TpN15、TpN17與TpN47重組抗原包被在微孔板上，采用雙抗原夾心法檢測梅毒螺旋體特異性抗體。其原理是利用包被的梅毒特異性抗原對血清中的抗體進行初篩，然后通過酶標記的特異性抗原再次進行篩選，因此增加了結(jié)果的特異性。該法可同時檢測IgM、IgG抗體，縮短了窗口期，提早了對感染后的檢出，特別是TP-IgM對早期梅毒、先天梅毒的診斷有重要意義。文獻報道TP-ELISA方法的敏感性高于熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)［14，15］，對一期梅毒的診斷靈敏度為93.8%，且生物學(xué)假陽性和假陰性發(fā)生率明顯低于RPR。該方法操作簡單，易于自動化，適合大批量樣本檢測，結(jié)果準確可靠，被公認為梅毒血清學(xué)診斷試驗的首選方法。

2.2.7 梅毒膠體金法(ICS):金標法是一種快速體外診斷技術(shù)。應(yīng)用基因重組技術(shù)制備梅毒螺旋體特異性基因工程抗原，采用膠體金標記和免疫層析技術(shù)，能夠高度特異的檢測待測血清中的抗體。可用于全血、血漿、血清的檢測，靈敏度高，可用于梅毒的快速檢測和相關(guān)篩查。膠體金法檢測TP-IgM還可用于診斷梅毒復(fù)發(fā)和再感染的檢測［16］。

2.2.8 化學(xué)發(fā)光法(CMIA):將TP抗原包被到固體鐵粒子上，使其與標本中的抗TP抗體反應(yīng)，再與酶標抗人IgG抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光基質(zhì)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光基質(zhì)的發(fā)光量可計算出標本中抗TP抗體的含量。Knight等［17，18］報導(dǎo)應(yīng)用此法檢測梅毒患者血清有很好的敏感性(95.8% ～100%)和特異性(99.1% ～100%)。但由于試劑成本較高且需要特殊儀器，目前未在臨床得到廣泛應(yīng)用。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測梅毒螺旋體DNA已在臨床得到應(yīng)用?，F(xiàn)PCR診斷梅毒的方法主要有常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量 PCR、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄 PCR)、巢式 PCR。Liu等［19］應(yīng)用PCR技術(shù)檢測生殖器潰瘍標本polA基因，敏感性為95.8%，特異性為95.7%。Leslie 等［20］應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測患者標本polA基因，敏感性為80.39%，特異性為98.40%。PCR技術(shù)敏感性高，但存在難于標準化的問題，其原因主要是由于引物來源不同以及各實驗室間DNA抽提方法存在差別，且臨床標本成分復(fù)雜，也進一步導(dǎo)致了該法難于標準化。所以建立對梅毒螺旋體高度特異的PCR方法尤為重要。PCR技術(shù)是梅毒血清學(xué)試驗的有益補充，在早期梅毒診斷中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，應(yīng)根據(jù)研究目的選擇恰當?shù)脑囼灧椒āＤ壳?，國?nèi)實驗室在進行梅毒常規(guī)篩查及療效觀察、判斷復(fù)發(fā)及再感染時常采用梅毒非特異性血清學(xué)試驗(RPR、TRUST等);各期梅毒的確診試驗常采用梅毒的特異性血清學(xué)試驗(TPPA、TPHA等);進行大規(guī)模梅毒篩查常采用雙抗原夾心法ELISA。隨著檢測技術(shù)的迅速發(fā)展，必將提供給更加簡便、快速、準確、低成本的梅毒診斷試劑，使梅毒患者得到早診斷、早治療，從而全面控制梅毒的流行。

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