細(xì)胞凋亡相關(guān)因子與耐藥性的關(guān)系研究進(jìn)展

郭淑芹 馬靜靜 張?jiān)屏?/p>

細(xì)胞凋亡和腫瘤多藥耐藥是目前制約腫瘤臨床療效的兩個(gè)重要因素，多數(shù)抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，如果發(fā)生凋亡逃逸即細(xì)胞抗凋亡能力提高如抗凋亡基因過表達(dá)或促凋亡基因丟失等，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞凋亡功能的異常不僅在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，還參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的MDR，使腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物誘導(dǎo)的凋亡耐受而產(chǎn)生耐藥性。許多調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的因子如SIRT1、Survivin、PUMA等可參與耐藥的發(fā)生。

1 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)

P-gp定位于染色體7q21，含1 280個(gè)氨基酸，是一種由人類(Multi-drug resistance 1 gene，mdr1)編碼的分子量為170 kD的跨膜糖蛋白，是ATP結(jié)合盒超家族(ATP-binding casette super family)成員之一，由兩個(gè)包含跨膜區(qū)和ATP結(jié)合區(qū)的同源性片段組成。P-gp主要定位于細(xì)胞膜上，該蛋白廣泛分布于小腸、膽管、胰腺等具有排泄和分泌功能的器官，其主要功能是通過結(jié)合ATP活化后將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外而降低胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致許多惡性腫瘤化療失敗。細(xì)胞耐藥既是正常細(xì)胞維持自身穩(wěn)定的防御機(jī)制之一，也是引起腫瘤化療失敗及腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。多藥耐藥基因表達(dá)的P-gp是化療耐藥的最有力指標(biāo)，P-gp可以將腫瘤細(xì)胞中不同結(jié)構(gòu)的藥物如長春花生物堿類、蒽環(huán)類、表鬼臼毒素、秋水仙堿、紫杉烷類等泵出細(xì)胞外［1］。P-gp的含量和細(xì)胞內(nèi)藥物的積聚量和耐藥程度呈明顯的相關(guān)性。

2 沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)

SIRT1是依賴于NAD+的Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，是sirtuin家族中研究最為廣泛的成員之一，在體內(nèi)可將組蛋白及多種非組蛋白去乙?；?，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，可延緩衰老，有“長壽基因”之稱［2］，并能促進(jìn)細(xì)胞生長、血管再生、血供重建、增強(qiáng)對化療的耐藥性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥方面起重要作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子 p53［4］、C-MYC［5］、沉默抑癌基因［6］、促進(jìn) MDR1的表達(dá)［7］參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥。在正常細(xì)胞中SIRT1是十分重要的抗衰老、抗代謝性疾病的蛋白，在腫瘤細(xì)胞中，正是SIRT1的抗凋亡作用使突變細(xì)胞逃避凋亡和衰老控制，而助于腫瘤或某些代謝性疾病的發(fā)生。

5種臨床腫瘤的活檢標(biāo)本和不同細(xì)胞來源的耐藥細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)SIRT1高水平表達(dá)，直接誘導(dǎo)MDR1的表達(dá)。用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明:在人的293細(xì)胞中，SIRT1可直接誘導(dǎo)MDR1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞對藥物的敏感性降低。SIRT1在活化的狀態(tài)下介導(dǎo)MDR1基因表達(dá)，使用RNAi特異性降低SIRT1表達(dá)后，P-gp和MDR1的表達(dá)明顯降低，提示長壽基因不僅與多藥耐藥性存在聯(lián)系，而且在多藥耐藥性中起積極作用。進(jìn)一步證實(shí)，SIRT1異位高表達(dá)誘導(dǎo)P-gp表達(dá)，使細(xì)胞對多柔比星產(chǎn)生耐藥性，下調(diào)SIRT1能逆轉(zhuǎn)抗藥顯性并且可以降低 P-gp 表達(dá)［8］。Ford 等［9］發(fā)現(xiàn)，SIRT1 的干擾能減低腫瘤細(xì)胞對一些藥物的敏感性，引起細(xì)胞生長的阻滯，通過下調(diào)SIRT1基因表達(dá)能促使惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，且不影響正常細(xì)胞的生長，與上述結(jié)果一致，利用siRNA技術(shù)將SIRT1沉默后，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞對藥物的耐受性降低并被誘導(dǎo)為生長停滯狀態(tài)［10］。FoXO1是 MDR1基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［11］，F(xiàn)oXO1可被 SIRT1 去乙?；琒IRT1 高表達(dá)可以增強(qiáng)FoXO啟動子的活性和細(xì)胞核中FoXO1的水平。Oh等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞中，F(xiàn)oXO1結(jié)合到MDR1基因啟動子上是反式激活MDR1基因的關(guān)鍵事件，提示FoXO1可能是多藥耐藥的靶點(diǎn)。

白藜蘆醇作為一種重要的植物抗毒素，可通過多種途徑預(yù)防腫瘤的發(fā)生，是繼紫杉醇之后的又一新的天然多酚類化合物。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用化療藥物5-氟尿嘧啶可降低CYP1B1基因的表達(dá)，發(fā)揮更強(qiáng)的抑制腫瘤生長作用。因此，白藜蘆醇可以作為一種輔助藥物來改善膽管癌對化療藥物的敏感性［13］。黃柏苷G(amurensin G)是從山葡萄中提取的天然SIRT1抑制劑，在應(yīng)用于耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞后，可以抑制FoXO1的活性和MDR1的表達(dá)，證實(shí)SIRT1在MDR1基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用，黃柏苷G有望成為一種新型的治療腫瘤耐藥的抑制劑。

SIRT1去乙酰化酶抑制劑不僅能抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制癌基因表達(dá)且毒副作用低，為克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性提供可能，從而為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥提供理論基礎(chǔ)，最終為治療腫瘤提供有力的線索。因此針對SIRT1的靶向治療是當(dāng)前腫瘤治療的一個(gè)熱點(diǎn)，用SIRT1去乙?；敢种苿┛朔[瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，有可能具有應(yīng)用前景。

3 生存素(Survivin)

Survivin蛋白是凋亡抑制基因家族(inhibitor of apoptosos，IAP)中的一員，普遍存在于原核和真核生物組織中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可抑制多種刺激因素誘導(dǎo)的凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞存活，利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，其高表達(dá)可抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Survivin可直接抑制casepase-3和 casepase-7的活性，有效阻斷細(xì)胞凋亡過程［14］，該機(jī)制被認(rèn)為是產(chǎn)生化療藥物耐藥的重要機(jī)制。有研究證明，下調(diào)Survivin表達(dá)可提高多種癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性［15-17］。Souza等［18］通過應(yīng)用Western blot、RT-PCR、免疫熒光測定法對早期敏感CML細(xì)胞株K562中P-gp和Survivin的檢測，證實(shí)了二者之間的關(guān)系，在K562細(xì)胞中大劑量的長春新堿可以誘導(dǎo)P-gp和Survivin高表達(dá)，同時(shí)伴隨細(xì)胞凋亡指數(shù)的降低，另外發(fā)現(xiàn)P-gp和Survivin同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)，提示二者可能通過某種共同的機(jī)制調(diào)控細(xì)胞凋亡。Survivin作為腫瘤內(nèi)在凋亡系統(tǒng)中的共同靶點(diǎn)，與細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路 PI3K/AKT、mTOR、HIF-1α、HSP90、p53、Bcl2、VEGF 等有著直接的調(diào)控關(guān)系［19］，PI3K/AKT信號通路參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡和致癌性轉(zhuǎn)化，Liu等［20］證實(shí)在多藥耐藥性乳腺癌 MCF-7中Survivin轉(zhuǎn)錄與P-gp/MDR1過表達(dá)相關(guān)，應(yīng)用特定的PI3K抑制劑LY294002后，二者的表達(dá)降低，同時(shí)抑制了Survivin啟動子的活性，增強(qiáng)了細(xì)胞對藥物的敏感性，Survivin轉(zhuǎn)錄通過 PI3K/AKT信號通路與 P-gp/MDR1相關(guān)。許多化療藥物可通過損傷DNA、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，而凋亡抑制蛋白Survivin可在藥物作用靶點(diǎn)后抑制化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生MDR表型。陳建發(fā)等［21］研究證實(shí)Suvivin siRNA可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29內(nèi)的Survivin表達(dá)，Survivin表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了caspase-3、Bax基礎(chǔ)表達(dá)水平的提高以及Bcl-2基礎(chǔ)表達(dá)水平的降低，并使細(xì)胞凋亡線粒體信號通路更易活化，從而降低結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29對化療藥物cisplatin更加敏感，進(jìn)而提示通過siRNA技術(shù)下調(diào)survivin表達(dá)，可能是靶向治療結(jié)直腸癌的一個(gè)可行手段。

血根堿(sanguinarine)最近被證實(shí)是一種新型的Survivin抑制劑，并且高選擇性的殺滅前列腺癌細(xì)胞，在激素非依賴性前列腺癌的進(jìn)展及對化療藥物的抵抗中發(fā)揮著重要作用，可能增加紫杉醇對腫瘤的敏感性，增強(qiáng)紫杉醇介導(dǎo)的腫瘤抑制與細(xì)胞凋亡［22］。在腫瘤疫苗方面，Tsuruma等［23］開始了Survivin-2B多肽疫苗治療結(jié)直腸癌的I期臨床試驗(yàn)。Survivin的凋亡抑制作用在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，已成為具有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)記物和腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，在逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性行為及治療方面具有廣闊的前景。

4 p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)

PUMA基因是2001年由三個(gè)研究小組應(yīng)用不同的策略發(fā)現(xiàn)的，是Bcl-2蛋白家族成員，因其可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大的促凋亡作用而得名，也因其強(qiáng)大的促凋亡作用使得它在生命科學(xué)研究領(lǐng)域備受關(guān)注。

PUMA基因定位于染色體19q，這個(gè)區(qū)域在大多數(shù)腫瘤中顯示缺失，蛋白定位于線粒體外膜，在多種病理性因素的刺激下通過p53依賴和非依賴途徑激活后，其BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2抗凋亡蛋白質(zhì)結(jié)合及激活Bax/Bak，引發(fā)線粒體功能障礙和caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在凋亡通路上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［24］。PUMA不僅能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而且還能增加腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，是非常有前景的腫瘤基因治療靶點(diǎn)。Yu等［25］將攜帶PUMA的重組腺病毒載體(Ad-PUMA)轉(zhuǎn)染到人肺腺癌549細(xì)胞中，并同時(shí)分別給予放療和化療藥物紫杉醇、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、順鉑等治療，發(fā)現(xiàn)在非放化療敏感性肺癌中，PUMA通過活化caspase，釋放Cytc，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖;而在放化療敏感性肺癌系中PUMA能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對放療及化療藥物的敏感性，并且發(fā)現(xiàn)Ad-PUMA可顯著抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。Chen等［26］在對裸鼠耐藥絨癌細(xì)胞jeg-3/vp16的研究中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行化療之前先用Ad-PUMA感染此耐藥細(xì)胞，當(dāng)加入化療藥物時(shí)，由PUMA表達(dá)下降導(dǎo)致的凋亡通路受阻已得到修復(fù)，此時(shí)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用得以充分實(shí)現(xiàn)，與未合用Ad-PUMA的對照組相比，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性明顯增加，證實(shí)Ad-PUMA可顯著增加耐藥絨癌對化療藥物的敏感性，Ad-PUMA與化療藥物合用后顯著促進(jìn)絨癌細(xì)胞的凋亡。Wang等［27］將攜帶PUMA和p53的重組腺病毒載體(Ad-PUMA、Ad-p53)分別與化療藥物順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶聯(lián)合處理人食管癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，PUMA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，且此增敏作用與p53無關(guān)，與Ad-p53相比，Ad-PUMA能更強(qiáng)地抑制癌細(xì)胞生長，增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

關(guān)于MDR，目前臨床上還有許多需要解決的難題，多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)就是其中之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種作用機(jī)理不同的逆轉(zhuǎn)劑作用于MDR的各個(gè)環(huán)節(jié)，但由于毒性等多種原因，在臨床應(yīng)用受到限制，尚待進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)研究的深入，越來越多的多藥耐藥相關(guān)基因及細(xì)胞因子陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，人們對腫瘤的耐藥機(jī)制有了更深入的理解，許多提示耐藥與凋亡存在內(nèi)在聯(lián)系的證據(jù)也相繼被發(fā)現(xiàn)。這些研究為進(jìn)一步闡明兩者之間的調(diào)控影響機(jī)制提供了新思路，揭示了其中復(fù)雜多樣的調(diào)控因素。通過深入研究腫瘤抗藥性與凋亡的關(guān)系，相信將有助于更好地指導(dǎo)腫瘤的臨床治療。

1 Xu Y，Zhi F，Xu G，et al.Overcoming multidrug-resistance in vitro and in vivo using the novel P-glycoprotein inhibitor 1416.Biosci Rep，2012，32，559-566.

2 Li Y，Tollefsbol TO.P16(INK4a)suppression by glucose restriction contributes to human celluar lifespan extension through SIRT1-mediated epigenetic and genetic mechanism.PLos One，2011，6:e17421.

3 Liu T，Liu PY，Marshall GM.The critical role of the classⅢ histone Deacetylase SIRT1 in cancer.Cancer Res，2009，69:1702-1705.

4 Yi J，Luo J.SIRT1 and p53，effect on cancer，senescence and beyond.Biochim Biophys Acta，2010，1804:1684-1689.

5 Mao B，Zhao G，Lv X，et al.Sirt1 deacetylates C-MYC and promotes CMYC/Max association.Int J Biochem Cell Biol，2011，43:1573-1581.

6 Pruitt K，Zinn RL，Ohm JE，et al.Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation.PLoSGenet，2006，2:e40.

7 Chu F，Chou PM，Zheng X，et al.Control of multidrug resistance gene mdr1 and cancer resistance to chemotherapy by the longevity gene sirt1.Cancer Res，2005，65:10183-10187.

8 Olmos Y，Brosens JJ，Lam EW.Interplay between SIRT1 proteins and tumor suppressor transcription factors in chemotherapeutic resisitance of cancer.Drug Resisit Updat，2011，14:35-44.

9 Ford J，Jiang M，Milner J.Cancer-specific functions of SIRT1 enable human epithelial cancer cell growth and survival.Cancer Res，2005，65:10457-10463.

10 Liang XJ，F(xiàn)inkel T，Shen DW，et al.SIRT1 contributes in part to cisplatin resistance in cancer cells by altering mitochondrial metabolism.Mol Cancer Res，2008，6:1499-1506.

11 Han CY，Cho KB，Choi HS，et al.Role of FoxO1 activation in MDR1 expression in adriamycin-resistant breast cancer cells.Carcinogenesis，2008，29:1837-1844.

12 Oh WK，Cho KB，Hien TT，et al.Amurensin G，a potent natural SIRT1 inhibitor，rescues doxorubicin responsiveness via down-regulation of multidrug resistance.Mol Pharmacol，2010，78:855-864.

13 Frampton GA，Lazcano EA，Li H，et al.Resveratrol enhances the sensitivity of cholangiocarcinoma to chemotherapeutic agents.Lab Invest.2010，90:1325-1338.

14 Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al.Surrvivin:key regulator of mitosis and novel target for cancer therapeutics.Clin Cancer Res，2008，14:5000-5005.

15 劉正人，李映良，武彪，等.靶向survivin的siRNA降低人乳腺癌MCF7-Adr耐藥細(xì)胞株對阿霉素耐受效應(yīng)的研究.山東醫(yī)藥，2010，50:101-102.

16 盧昕，鄭啟昌.靶向survivin的siRNA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞化療敏感性的研究.中國普通外科雜志，2010，19:875-880.

17 張曙光，劉曉凡，杜江，等.survivin-siRNA抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其對順鉑的敏感性.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16:583-587.

18 Souza PS，Vasconcelos FC，De Souza Reis FR，et al.P-glycoprotein and survivin simultaneously regulate vincristine-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells.Int J Oncol，2011，39:925-933.

19 Kanwar JR，Kamalapuram SK，Kanwar RK.Survivin Signaling in Clinical Oncology:A Multifaceted Dragon.Med Res Rev，2012，41:478-479.

20 Liu F，Liu S，He S，et al.Survivin transcription is associated with P-glycoprotein/MDR1 overexpression in the multidrug resistance of MCF-7 breast cancer cells.Oncol Rep，2010，23:1469-1475.

21 陳建發(fā)，李宇華，陳引香，等.Survivin siRNA提高人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對順鉑化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25:391-394.

22 Sun M，Lou W，Chun JY，et al.Sanguinarine suppresses prostate tumor growth and inhibits survivin expression.Genes Cancer，2010，1:283-292.

23 Tsuruma T，Hata F，Torigoe T，et al.Phase I clinical study of anti-apoptosis protein，survivin-derived peptide vaccine therapy for patients with advanced or recurrent colorectal cancer.J Transl Med，2004，2:19.

24 Hikisz P，Kiliańska ZM.Puma，a critical mediator of cell death-one decade on from its discovery.Cell Mol Biol Lett，2012，17:646-669.

25 Yu J，Yue W，Wu B，et al.PUMA sensitizes lung cancer cells to chemotherapeutic agents and irradiation.Clin Cancer Res，2006，12:2928-2936.

26 Chen Y，Qian H，Wang H，et al.Ad-PUMA sensitizes drug-resistant choriocarcinoma cells to chemotherapeuticagents.Gynecol Oncol，2007，107:505-512.

27 Wang H，Qian H，Yu J，et al.Administration of PUMA adenovirus increases the sensitivity of esophageal cancer cells to anticancer drugs.Cancer Biol Ther，2006，5:380-385.