流感嗜血桿菌外膜蛋白及免疫特性

趙青

流感嗜血桿菌，簡稱嗜血桿菌(haemophilus influenzae，Hi)，該菌是由波蘭細(xì)菌學(xué)家費(fèi)佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中發(fā)現(xiàn)的，發(fā)現(xiàn)該菌之初，人們誤以為其是導(dǎo)致流行性感冒的病因，到1933年流行性感冒病毒性病原體被分離出來之后，人們才消除了對此的誤解。Hi可引發(fā)肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎、會厭炎等疾病，其侵襲性的感染可導(dǎo)致腦膜炎和菌血癥等［1］，給人類的健康帶來嚴(yán)重的危害，據(jù)調(diào)查在歐洲流感嗜血桿菌已經(jīng)成為獲得性肺炎中的第二大病原菌［2］。Hi的人群攜帶率很高，是一些疾病的重要病原菌。該菌疫苗的獲得主要是通過對其外膜蛋白的研究，因此本文主要對常見的外膜蛋白主要從其特性和抗藥機(jī)制兩個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)介紹，以便日后深入研究該病原體。流感嗜血桿菌，是一類革蘭陰性、需氧或兼性厭氧菌，常定位于局部的呼吸道、中耳、結(jié)膜等處，其對生長的環(huán)境要求較高，且在人工培養(yǎng)時(shí)需加入新鮮的血液，它自身生長主要依賴于Ⅴ和Ⅹ因子。根據(jù)有無莢膜其可分為莢膜型和無莢膜型(nontypeable haemophilus influenzae，NTHi)兩種類型。以往的研究指出只有莢膜型菌株可致病，莢膜型又可分為a～f六個(gè)血清型，其中又以b血清型(Hib)的侵襲力最強(qiáng);然而近來的研究多顯示，在感染Hi的患者中最常見的菌株是NTHi，特別是在呼吸道感染中NTHi已成為了主要致病菌［3］，它們首先寄居在鼻咽部，然后通過咽鼓管到達(dá)中耳，常引起呼吸道的反復(fù)感染。通過研究，Hi外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)常被用做疫苗的研制來防止人類感染此病毒。Hi的外膜蛋白主要有 P6、P2、P26、P5、P4、脂蛋白 D(LPD)、Haps 蛋白、Hia蛋白等。

1 外膜蛋白P6

1.1 P6生物特性 Hlrano等［4］首次分離出外膜蛋白P6(outer membrane protein P6，P6)，證實(shí)其存在于所有Hi菌株上，研究指出其免疫交叉反應(yīng)暴露于細(xì)胞表面;P6是一種肽聚糖偶聯(lián)的脂蛋白，也是一個(gè)整合蛋白，其分子量為16-kDa，在所有外膜蛋白中所占比重僅為1% ～5%［5］，但其作用是不容忽視的;P6蛋白在維持細(xì)胞外膜的完整性方面具有重要作用，其錨定于NTHi菌體外膜上，通過對缺乏P6基因表達(dá)的NTHi突變體的研究表明，缺乏P6基因表達(dá)的菌株生長緩慢，其細(xì)胞壁的完整性降低，脆性增加，對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有很強(qiáng)的敏感性［6］;在外膜蛋白中，P6蛋白是唯一一個(gè)不溶于37℃、1%SDS-0.5 mmol/L NaCl-0.1% β-巰基乙醇溶液的蛋白，但在60℃時(shí)可釋放到細(xì)胞外［7］。

1.2 P6免疫特性 P6有殺菌免疫活性。P6有一個(gè)Pam半骯氨酸末端模序，與Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)偶聯(lián)，P6能夠激活TLR2，而TLR2又可激活NF-kB，進(jìn)而來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的活化［8］，引起對OMP的獲得性免疫應(yīng)答。通過菌株的預(yù)測氨基酸序列對比表明，多菌株間的序列各不相同，然而P6菌株間的氨基酸序列差異卻不大，由此可見 P6相當(dāng)保守。通過P6的單抗和多抗血清檢測表明，其基因序列具有高度保守性［9］，在 Hi菌株間的保守性分別為 97%、100%［10］，P6是一個(gè)位于流感桿菌表面的高度保守的抗原。

研究顯示P6抗體對機(jī)體具有保護(hù)性。Demaria等［11］單獨(dú)用P6蛋白免疫南美栗鼠并進(jìn)行細(xì)菌的攻擊實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)產(chǎn)生了較高的抗體，且該抗體具有保護(hù)性;這些抗體能夠加速清除NTHi病原菌［12］，使得實(shí)驗(yàn)中動物的恢復(fù)速度增快［13］;P6在體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答及特異性黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中均有重要的作用。

通過利用毛絲鼠動物模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)P6、PCP-PAL和P4復(fù)合物聯(lián)合免疫動物時(shí)，動物能產(chǎn)生高滴度抗體，但該抗體卻沒有殺菌活性及免疫保護(hù)性，這可能是因?yàn)镻6在單獨(dú)免疫時(shí)形成了的二聚體受復(fù)合物的影響使得P6蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變，因此屏蔽了具有保護(hù)性的抗原表位，這也從另一個(gè)側(cè)面表明P6蛋白的構(gòu)象在機(jī)體產(chǎn)生有效抗體中扮演著重要的角色。

1.3 P6蛋白的應(yīng)用 由于P6抗原的高度保守性，可疫苗研制中起十分重要作用，也是目前最有前景的疫苗候選菌株。基于P6基因的高度保守性，可用于鑒別流感嗜血桿菌及溶血性嗜血桿菌［14］。通過利用P6基因設(shè)計(jì)引物，用PCR檢測極大的提高陽性率。

2 外膜蛋白P2

2.1 P2的生物特性 外膜蛋白P2(outer membrane protein P2，P2)的分子量為36～42 kD，它是具有8個(gè)外露表面環(huán)(loops)和16個(gè)跨膜區(qū)的蛋白質(zhì);它在細(xì)胞膜的表面含量約占所有OMP含量的1/2，能夠形成三聚體，且具有膜孔蛋白的活性，允許小于1400 Da的分子通過［15］。

2.2 P2的免疫特性 P2具有很強(qiáng)的免疫原性，且P2可以通過與宿主體內(nèi)的層粘連蛋白受體結(jié)合介導(dǎo)NTHi的粘附［16］。研究發(fā)現(xiàn)，P2在黏膜免疫中可針對大多數(shù)菌株(同源的和異源的)的表面抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，起到殺菌效果［17］。由于P2的免疫應(yīng)答受到異源性的限制，因此對其保守抗原的研究十分必要。研究發(fā)現(xiàn)，表面暴露區(qū)域 loop6存在于所有菌株上，但loop6區(qū)域的保守性也是相對的。因此，用P2制作疫苗應(yīng)克服外膜蛋白P2潛在的抗原異質(zhì)性和點(diǎn)突變。

3 外膜蛋白P26

外膜蛋白P26(outer membrane protein P26，P26)，分子量為26 kD，天然的P26沒有熱修飾特性，它由134個(gè)氨基酸組成，攜帶一由23個(gè)氨基酸組成的N端信號序列。其N端和C端末端是疏水的，由親水性區(qū)域?qū)⑵浞珠_，序列與巴氏桿菌的伴侶蛋白(seventeen—kilodal.ton protein，Skp)有一定的同源性，而且Skp家族在腸桿菌科中具有高度的保守性。有研究顯示P26抗體與同源、異源菌株的清除有關(guān)［15］。

4 外膜蛋白P5

外膜蛋白P5(outer membrane protein P5，P5)，是分子量約為27 kD的一種熱修飾蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得的等電點(diǎn)為6.3～6.8，與 E.coli OmpA 同源［18］。P5可粘附于上皮細(xì)胞，是通過細(xì)胞粘附素(CEACAMs)的癌胚抗原家族尤其是CEACAM1介導(dǎo)的，依賴蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用與CEACAMI分子結(jié)合，直接抑制機(jī)體免疫細(xì)胞活性，使得NTHi可通過跨細(xì)胞和胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用穿過呼吸道單層上皮細(xì)胞從而感染機(jī)體［19］。

P5蛋白外露表面環(huán)根據(jù)異源性可分為loop1、loop2、loop3、loop4四種。在關(guān)于南美栗鼠動物模型的研究中，特別是在loop3基礎(chǔ)上制備疫苗。由P5制備而成的疫苗在機(jī)體可產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫兩種應(yīng)答機(jī)制，因而P5蛋白具有免疫保護(hù)性［20］。研究表明P5在細(xì)胞膜上對陽離子存在不對稱選擇性［18］，該性質(zhì)在疫苗的研制方面有望成為突破，因而P5也很有希望成為疫苗候選株。

5 外膜蛋白P4

外膜蛋白P4(outer membrane protein P4，P4)，分子量為28 000～30 000，由kZ基因編碼，是一高度特異的酸性磷酸單酯酶。它存在于所有Hi中，它在菌體獲取凝血因子Ⅹ中具有重要作用，為細(xì)菌生長所必須。

實(shí)驗(yàn)研究表明，用P4免疫動物產(chǎn)生的抗體也具有殺菌活性。但P4是一種具有酶活性的蛋白，在人體尤其是嬰兒中使用會存在很多的問題。Hotomi等［21］指出，利用定點(diǎn)突變方法，通過將蛋白序列上的天冬氨酸殘基置換掉，在不影響其免疫原性的情況下，可顯著降低P4的酶活性。雖然P4對于獲取凝血因子X具有重要作用，但目前它在該過程中的具體作用尚未研究透徹。

6 其他外膜蛋白

6.1 Hia蛋白 Hia蛋白與細(xì)菌的粘附有關(guān)，是自動運(yùn)輸體蛋白質(zhì)家族中的一員，因其在細(xì)胞內(nèi)碳末端區(qū)域并未進(jìn)行加工與細(xì)胞的聯(lián)系完整，而又有別與其他的自動運(yùn)輸體蛋白，能極大的增加細(xì)菌的粘附性［22］。

6.2 脂蛋白D 脂蛋白D(LPD)是分子量為42 kD的膜相關(guān)免疫球蛋白結(jié)合蛋白，位于Hi表面，和人IgD 有親和性［23，24］;其免疫原性高度保守，是 Hi的特征性毒力決定因子。

研究表明，脂蛋白D有甘油磷酸二酯酶的活性，可引起宿主上皮細(xì)胞釋放磷酰膽堿，降低上皮細(xì)胞纖毛運(yùn)動的頻率，在促進(jìn)黏附、吞噬及細(xì)菌侵入人單核細(xì)胞過程中表現(xiàn)出重要作用，但動物實(shí)驗(yàn)顯示不能用LPD免疫來預(yù)防大鼠中耳炎。

6.3 HxuA蛋白 HxuA蛋白，分子量為100 kDa。所有的流感嗜血桿菌的生長均需一種含鐵化合物，血紅素，由于流感嗜血桿菌不能自身合成血紅素，故其必須從人類宿主獲取血紅素后才能生長并引起感染;流感嗜血桿菌分泌的HxuA蛋白就是用來攝取血紅素的維持自身生長的重要蛋白［15］。

7 4Sap蛋白

Sap蛋白是流感嗜血桿菌具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白，用于亞鐵血紅素的轉(zhuǎn)導(dǎo)［25］。

綜上所述，流感嗜血桿菌外膜蛋白的種類很多，因其高攜帶率和致病性，目前多用于疫苗的研制，研究較為透徹的為P6，同時(shí)由于細(xì)菌的粘附性，對于其粘附機(jī)制也可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

鑒于Hi的廣泛性，和外膜蛋白的多樣性，在臨床中我們可用其進(jìn)行該菌的檢測以提高檢測的陽性率，或通過對外膜蛋白的清晰認(rèn)識將幾種蛋白融合起來用于疫苗的制備，這樣對于流感嗜血桿菌的感染也可起到有效的防御。

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