應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)快速鑒別診斷菌陰肺結(jié)核

王 琳,翁麗珍,陳曉紅,黃明翔,李學(xué)玲,林劍東,郭志平,熊麗君,劉坦業(yè)

我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)和全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一。目前每年新發(fā)生的結(jié)核病人約130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第2位。2010年全國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果表明，我國活動性肺結(jié)核患病率為459/10萬，其中菌陰肺結(jié)核占活動性肺結(jié)核比例高達(dá)73.5%(963/1 310)[1]。值得重視的是，肺部感染性疾病(簡稱肺炎)也是最常見的一種呼吸系疾病，其中90%以上是社區(qū)獲得性肺炎(CAP)。一些肺炎尤其是嚴(yán)重耐藥性肺炎也已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。這兩者的早期診斷、鑒別診斷卻存在很高的難度。

菌陰肺結(jié)核與肺炎的影像學(xué)及臨床特點(diǎn)極為相似，是否有典型肺部影像學(xué)的表現(xiàn)，是菌陰肺結(jié)核診斷能否成立的重要依據(jù)，對于數(shù)字成像(DR)胸片顯示孤立病灶的患者臨床診斷難度更大[2]。為此，部分肺炎、肺部腫瘤、肺結(jié)核患者，僅靠影像學(xué)、血清學(xué)檢驗(yàn)、細(xì)菌學(xué)檢測、結(jié)核菌蛋白衍化物(PPD)皮膚試驗(yàn)等技術(shù)難以獲得早期鑒別診斷結(jié)果。

蛋白指紋圖譜技術(shù)(proteomic fingerprinting, PFP)是近幾年發(fā)展起來的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)[3]。在對臨床疾病檢測時，抓住絕大多數(shù)疾病都有特異的蛋白生物標(biāo)志的本質(zhì)，從而進(jìn)行疾病監(jiān)測和識別。它具有高通量、高重復(fù)性及高靈敏度與特異度等特點(diǎn), 國內(nèi)外應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)于惡性腫瘤已取得很好的效果，但國內(nèi)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)于肺部疾病的診斷僅見少數(shù)報(bào)道。

本研究主要探討菌陰肺結(jié)核與肺炎患者相關(guān)蛋白指紋圖譜的特征性，選擇兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白峰建立診斷模型，指導(dǎo)臨床早期診斷及治療。

1 材料與方法

1.1選例標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1選擇根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS 196-2001)《結(jié)核病分類》診斷標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)臨床診斷的菌陰肺結(jié)核患者(A組)60例，男性31例(51.7%)，女性29例(48.3%)，平均年齡45.8歲。

1.1.2根據(jù)《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》(中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會，2008)標(biāo)準(zhǔn)確診為肺炎的患者(B組)60例，男性33例(55.0%),女性27例(45.0%)，平均年齡44.3歲。

以上病例均無其它并存病，非妊娠、哺乳期婦女，無精神病、癲癇、過敏性哮喘、肺部腫瘤病史。

1.1.3健康者(C組)60例，均為學(xué)生，經(jīng)結(jié)核菌蛋白衍化物(PPD)試驗(yàn)皮膚反應(yīng)直徑≤10 mm，X線(CT)胸片無結(jié)核病變、無肺外結(jié)核病、無其它肺部疾病。年齡18～23歲，平均年齡20.8歲。

1.2血清蛋白指紋檢測方法

1.2.1主要儀器及樣品準(zhǔn)備 選用美國 Ciphergen 公司產(chǎn)品Ciphergen ProteinChip System，CPCS，型號：PBS II/C型 蛋白指紋圖譜儀。WCX蛋白磁珠(WCX Magnetic Beads)(湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司)。

血清樣品準(zhǔn)備：抽取各組患者及健康者清晨空腹前臂靜脈全血2 mL，置于4 ℃冰箱中1～2 h，然后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝后，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2步驟

1.2.2.1血清樣品處理 取5 μL血清樣品加10 μL裂解液混合孵育30 min后，加入185 μL緩沖液稀釋。

1.2.2.2取磁珠50 μL加入200 μL-PCR Tube中，磁鐵上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube加入50 μL緩沖液洗脫5 min后，磁鐵上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube再次加入100 μL緩沖液洗脫5 min，PCR Tube磁鐵上孵育1 min，PCR Tube加入100 μL處理好的血清樣品。

1.2.2.3加入血清樣品的PCR Tube置于室溫孵育30 min，PCR Tube磁鐵上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入100 μL緩沖液洗脫5 min，PCR Tube磁鐵上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入10 μL洗提 緩沖液 洗脫5 min，PCR Tube磁鐵上孵育1 min，取5 μL上清液移至另一PCR Tube中，PCR Tube加入5 μL SPA飽和溶液充分混勻，取1 μL混合溶液加樣到Au/Steel芯片上風(fēng)干。

1.2.3數(shù)據(jù)收集 待芯片干燥后，ProteinChip System Ⅱc質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。用Ciphergen ProteinChip 3.0軟件自動采集數(shù)據(jù)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Biomarker Pattern5.0軟件對芯片檢測得到的蛋白質(zhì)相對含量及蛋白質(zhì)質(zhì)荷比數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有測得的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。對所獲的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多峰分析法，尋找差異峰，以具有差異峰表達(dá)者，且表現(xiàn)為高表達(dá)或低表達(dá)判斷為陽性，沒有差異蛋白峰表達(dá)者判斷為陰性。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算 (x、s、P值，建立診斷模型并評價其靈敏度，特異性，陽性與陰性預(yù)測值及總準(zhǔn)確率。

2 結(jié) 果

2.1在分子量0～50 000 m/z內(nèi)范圍對所繪制的蛋白峰進(jìn)行分析比較 120例菌陰肺結(jié)核與肺炎患者及60例健康者血清中，共獲得367個蛋白峰，其中5個峰(1 028.49、4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z)在菌陰肺結(jié)核、肺炎、健康者之間表達(dá)有顯著的差異性，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中1 028.49 m/z在肺炎病例中表現(xiàn)為高表達(dá)，在菌陰肺結(jié)核病例中表現(xiàn)為低表達(dá)；4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z在菌陰肺結(jié)核患者中表現(xiàn)為高表達(dá)，而在肺炎患者中表現(xiàn)為低表達(dá)。菌陰肺結(jié)核、肺炎與健康者之間差異峰均值、標(biāo)準(zhǔn)差見表1。

表1菌陰肺結(jié)核、肺炎和健康者有顯著差異的5個蛋白峰

Tab.1Thefifthproteinpeaksthatweresignificantlydifferentbetweenpulmonarytuberculosis,pneumoniaandhealthyvolunteers

Protein peak (m/z)Bacteriological negative pulmonary tuberculosis(x±s )Pneumonia(x±s)Healthy volunteers(x±s)P value1 028.49-0.42±4.612.09±4.171.93±1.1004 796.563.94±4.191.943±3.301.01±1.6207 564.776.27±8.732.92±2.582.98±3.870.0088 048.0243.92±13.084.03±1.804.08±1.90011 526.755.17±2.480.36±0.620.34±0.820

2.2以5個蛋白峰(1 028.49、4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z)組成的模型鑒別診斷菌陰肺結(jié)核與肺炎的敏感性與特異性分別均為82.5%(52/63)，85.9%(49/57)；總有效率為84.2%(101/120)；陽性預(yù)測值86.7%(52/60)和陰性預(yù)測值為81.7%(49/60)。該診斷模型在判別肺炎、菌陰肺結(jié)核患者與健康者之間，總有效率達(dá)89.4%(161/180)，特異性為100%(60/60)靈敏度為84.2%(101/120)，陽性預(yù)測值100%(101/101)，陰性預(yù)測值75.9%(60/79)；菌陰肺結(jié)核與肺炎、健康者3組預(yù)測情況見表2；差異蛋白峰代表8 048.02、1 028.49 m/z，見圖1。

表2 菌陰肺結(jié)核與肺炎、健康者之間預(yù)測情況

Note: Between pneumonia and healthy volunteersχ2=82.82,P<0.01; between bacteriological negative pulmonary tuberculosis and healthy volunteersχ2=91.76,P<0.01; between pneumonia and bacteriological negative pulmonary tuberculosisχ2=115.06,P<0.01.

3 討 論

病原體診斷和針對性治療是控制結(jié)核病流行的有效措施，也是降低肺炎病死率的關(guān)鍵。為此，如何快速鑒別肺結(jié)核、肺炎的診斷、施以針對性的有效治療，便成為當(dāng)務(wù)之急。

蛋白指紋圖譜技術(shù)(PFP),是通過蛋白指紋圖譜儀利用激光脈沖輻射使芯池中的分析物解析形成荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比的離子在儀器場中飛行的時間長短不一，由此繪制出一張質(zhì)譜圖案。其閱讀器的準(zhǔn)確率為氫原子的十分之一，這表明蛋白指紋圖譜儀使醫(yī)院進(jìn)入原子級別的診斷世紀(jì)。蛋白指紋圖譜技術(shù)特點(diǎn)是，在對臨床疾病檢測時，抓住絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志的本質(zhì)，從而進(jìn)行疾病監(jiān)測和識別，即可對生物標(biāo)志做直接鑒定，故優(yōu)于其他如ELSIA、免疫熒光試驗(yàn)等其它間接測定生物標(biāo)志的方法。同時，由于有一套靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)來檢測和識別這些微量生物標(biāo)志，因而決定了它在臨床檢測中的敏感度和準(zhǔn)確性。

蛋白指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用在肺部炎癥上最典型的例子是應(yīng)用于SARS診斷。中國學(xué)者對早期病人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)病人在臨床發(fā)病早期(1～7 d),即可檢測出相關(guān)的特異蛋白,其敏感性為98.16%,特異性為94.16%[4]。

2006年Agranoff等首次研究了結(jié)核病人血清的蛋白指紋圖譜，采用表面加強(qiáng)激光解吸-電離飛行時間質(zhì)譜(Surface-enhanced laser desorption/ionization tiom of flight mass spectrometry SELDI-TOF-MS)技術(shù)分析179份活動性結(jié)核病與170份非結(jié)核對照組血清蛋白質(zhì)譜，檢測具有潛在診斷價值的生物標(biāo)記物，結(jié)果顯示診斷結(jié)核病的靈敏度為93.5%，特異度為94.9%，并不受HIV的影響，而且SELDI-TOF-MS技術(shù)具有能夠高能量分析大量樣品的指紋圖譜的優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)組學(xué)用于結(jié)核病的診斷提供了科學(xué)的依據(jù)[5]。

圖1菌陰肺結(jié)核、肺炎和健康者的8048.02、1028.49m/z血清蛋白峰

Fig.1Proteinpeakedat8048.02and1028.49m/zamongbacteriologicalnegativepulmonarytuberculosis,pneumoniaandhealthyvolunteers

王琳等“蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在肺結(jié)核、肺癌鑒別診斷中的應(yīng)用研究”，發(fā)現(xiàn)有4種蛋白峰傾向于肺結(jié)核診斷[6]；翁麗珍等“肺結(jié)核蛋白指紋圖譜診斷技術(shù)研究”通過建立診斷模型判別肺結(jié)核的特異性為100%，靈敏度為88.5%，有效率為92.3%[7]。

本研究按《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》(中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會，2008)標(biāo)準(zhǔn)，選擇菌陰肺結(jié)核、肺炎、健康者3組人群，每組各60例，進(jìn)行血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測，找出3組間的特異蛋白質(zhì)生物標(biāo)志及其差異性，為菌陰肺結(jié)核、肺炎的早期診斷提供快速、敏感、特異性強(qiáng)的科學(xué)診斷依據(jù)，也為肺炎蛋白指紋圖譜庫的建立提供重要資料。

蛋白指紋圖譜技術(shù)可以在1h 內(nèi)取得報(bào)告，使臨床醫(yī)生更早期鑒別診斷菌陰肺結(jié)核與肺炎，為爭取盡早治療，提高療效贏得寶貴時間。我們認(rèn)為，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)具有方法簡便、檢測快速，標(biāo)本用量少的優(yōu)點(diǎn)，是篩選結(jié)核病特異性標(biāo)志物的有效手段，可以彌補(bǔ)痰培養(yǎng)結(jié)核分支桿菌等檢查費(fèi)時長等不足，有望成為菌陰肺結(jié)核與肺炎的早期輔助診斷指標(biāo)。

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