艾葉揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化

趙志鴻 耿 楠 黃勇勇 吳 芳 李錦玉 王桂芳 張壯麗 張小俊

1.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州 450052；2.河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001；4.鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，河南鄭州 450001

艾葉為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉，全國(guó)各地區(qū)均產(chǎn)，資源豐富。 現(xiàn)代研究顯示，其主要含有揮發(fā)油、甾萜類、黃酮類、香豆素類、多糖及一些小分子成分等[1-3]，其中揮發(fā)油、黃酮類為主要有效成分[4-6]。艾葉是我國(guó)歷史悠久且臨床常用的中藥材[7]，有溫經(jīng)止血、散寒止痛、降濕殺蟲等[8]功效，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)表明其具有增強(qiáng)免疫抗感染、平喘鎮(zhèn)咳、護(hù)肝利膽、止血與抗凝血及抗自由基等作用[9-11]，揮發(fā)油是艾葉的主要藥效成分群之一，提取方法和工藝是揮發(fā)油質(zhì)量和藥理活性的保證，對(duì)于艾葉資源的開(kāi)發(fā)利用也具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油具有抗乙肝病毒作用，并對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了分析[12]，為將其研制成抗乙肝病毒新藥，研究揮發(fā)油的提取工藝。水蒸氣蒸餾法適合工業(yè)生產(chǎn)推廣，環(huán)保、經(jīng)濟(jì)。 本文以正交試驗(yàn)法[13-14]對(duì)艾葉揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化， 可提高揮發(fā)油的收率和質(zhì)量，降低成本，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

艾葉產(chǎn)地河南省駐馬店，由河南省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)科董誠(chéng)明教授鑒定為菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉。使用時(shí)粉碎使通過(guò)二號(hào)至三號(hào)篩，混合均勻。

1.1.2 儀器及試劑

揮發(fā)油提取器 （相對(duì)密度小于1 型）；KDM-4 型電子可調(diào)自動(dòng)恒溫儀（山東菏澤市儀器制刷廠制造）；電子天平AR1530（梅特勒-托利多儀器上海有限公司制造）；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 艾葉揮發(fā)油的提取方法

參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅩD 揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）[15]。 取粉碎的艾葉約100.00 g，精密稱定，加蒸餾水適量，浸泡，加熱提取，收集揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油得率，密封，冷藏保存。艾葉揮發(fā)油得率計(jì)算公式：揮發(fā)油得率（%）＝A/B×100%。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別考察料液比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)艾葉揮發(fā)油得率的影響。

1.2.2.1 料液比的影響 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，浸泡2 h，提取3 h，各條件分別平行3次，考察不同的料液比下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.2.2 浸泡時(shí)間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡時(shí)間分別?。?、1、2、4、6 h，提取3 h，各條件分別平行3 次，考察不同的浸泡時(shí)間下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.2.3 提取時(shí)間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡2 h，提取時(shí)間分別為：1、2、3、4、5 h， 各條件分別平行3 次，考察不同的提取時(shí)間時(shí)下葉揮發(fā)油的得率。

1.2.3 正交試驗(yàn)及最優(yōu)提取條件的驗(yàn)證

1.2.3.1 因素水平設(shè)計(jì) 由單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇考察因素為提取時(shí)間（A）、料液比（B）和浸泡時(shí)間（C），各因素分別設(shè)3 個(gè)水平，考察指標(biāo)為揮發(fā)油得率，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。 見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，按表2 設(shè)計(jì)的L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3.3 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn) 以優(yōu)選出的提取條件進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，以RSD 值小于5%為必要條件，確定優(yōu)化條件下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[16-17]，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，采用t 檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)表

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比的影響

料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16時(shí)，對(duì)應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.350±0.017）%、（0.424±0.013）%、（0.421±0.016）%、（0.414±0.021）%、（0.408±0.014）%，二者關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 料液比與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖1 試驗(yàn)結(jié)果看出：在浸泡2 h、提取時(shí)間為3 h 的提取條件下， 料液比各水平間的揮發(fā)油得率由高到低依次為：1∶10＞1∶12＞1∶14＞1∶16＞1∶8。料液比為1∶10 時(shí)得率最高，為（0.424±0.013）%，與料液比1∶8 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而與1∶12、1∶14、1∶16 之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），即料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 對(duì)揮發(fā)油的得率并無(wú)太大影響，但由于料液比在1∶10、1∶12 時(shí)揮發(fā)油得率較高，且綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)成本，選擇正交試驗(yàn)中料液比的各水平為1∶10、1∶12、1∶14。

2.1.2 浸泡時(shí)間的影響

浸泡時(shí)間分別為：0、1、2、4、6 h，對(duì)應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.343±0.021）%、（0.378±0.014）%、（0.425±0.013）%、（0.417±0.012）%、（0.365±0.022）%， 二者關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 浸泡時(shí)間與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖2 試驗(yàn)結(jié)果看出：料液比1∶12、提取時(shí)間為3 h 的提取條件下， 依艾葉揮發(fā)油得率高至低順序的浸泡時(shí)間為：2 h＞4 h＞1 h＞6 h＞0 h。 艾葉經(jīng)浸泡后提取較不浸泡揮發(fā)油得率提高。 其中浸泡2 h 的得率最高，為（0.425±0.013）%，約高于不浸泡時(shí)得率的23.91%，與浸泡4 h 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），浸泡時(shí)間超過(guò)4 h 后，揮發(fā)油得率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），浸泡1、2、4 h 揮發(fā)油得率較高。 因此，在正交試驗(yàn)中浸泡時(shí)間水平選擇為1、2、4 h。

2.1.3 提取時(shí)間的影響

提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h， 對(duì)應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.312±0.012）%、（0.365±0.019）%、（0.412±0.014）%、（0.418±0.014）%、（0.420±0.016）%， 二者關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖3 試驗(yàn)結(jié)果看出：在料液比1∶12、浸泡時(shí)間為2 h 的條件下，提取時(shí)間各水平間的揮發(fā)油得率由高到低依次為：5 h＞4 h＞3 h＞2 h＞1 h。 揮發(fā)油得率隨著提取時(shí)間的增加而增加， 提取時(shí)間由1 h 增至3 h時(shí)，得率由（0.312±0.012）%增至（0.412±0.014）%，增加約32.05%，且3、4、5 h 得率顯著增加，與2 h 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。 3 h 后得率間的增加差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），5 h 比3 h 僅增加約1.94%，綜合考慮成本，正交試驗(yàn)中提取時(shí)間選擇1、2、3 h 三個(gè)水平。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3， 利用正交試驗(yàn)軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 L9（3）4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 方差分析表

由表3 得知，RA＝0.096、RB＝0.007、RC＝0.021 各因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，即直觀分析：A 是最重要因素，對(duì)結(jié)果影響最大，其次是C，B 是最次要因素。 方差分析結(jié)果表明： 對(duì)艾葉揮發(fā)油得率的影響，A 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），B 和C 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 兩者結(jié)果一致，提取時(shí)間是艾葉揮發(fā)油得率的主要影響因素。

根據(jù)揮發(fā)油提取條件的優(yōu)選原則， 由表3 可知：kA3＞kA2＞kA1，kB1＞kB3＞kB2，kC3＞kC2＞kC1確定艾葉揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3，即料液比選擇1∶10，浸泡4 h，提取3 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

由表5 結(jié)果顯示，在優(yōu)選的提取條件下，艾葉揮發(fā)油平均得率為0.416%，RSD=2.64%（n=3）， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

表5 最優(yōu)提取工藝（A3B1C3）下的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)考察并選擇正交試驗(yàn)各因素水平，用正交試驗(yàn)對(duì)艾葉揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選， 對(duì)優(yōu)選出的最佳工藝條件進(jìn)行了驗(yàn)證，證明重復(fù)性好，方法可行，結(jié)果可靠。

揮發(fā)油常見(jiàn)的提取方法有水蒸氣蒸餾法、 微波法、溶劑回流法、超臨界流體萃取法等，其中水蒸氣蒸餾法是分析植物中揮發(fā)性成分的傳統(tǒng)提取技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、效率較高，適合工業(yè)生產(chǎn)推廣，環(huán)保、經(jīng)濟(jì)[18-19]。

以水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油時(shí)，揮發(fā)油由水介質(zhì)慢慢浸出，隨水蒸氣蒸出，因此應(yīng)適當(dāng)選擇艾葉與水的比例。水量少時(shí)，水散作用進(jìn)行不徹底，艾葉不能被充分浸泡，蒸氣量生成的就少，得油率將受到影響，試驗(yàn)中當(dāng)料液比為1∶8 時(shí)，上述原因使得揮發(fā)油得率不高；料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 時(shí)，揮發(fā)油得率較高，分析原因可能是水量增大，水與揮發(fā)油兩者的接觸界面濃度差增大，更利于揮發(fā)油的擴(kuò)散和溶解，從而使傳質(zhì)速率得到提高；若加水量過(guò)多，會(huì)增加耗能，從而使工業(yè)生產(chǎn)成本增加，因此試驗(yàn)中料液比的水平為1∶10、1∶12、1∶14。

艾葉揮發(fā)油得率隨提取時(shí)間的增加而增加，3 h前揮發(fā)油得率增加明顯，3 h 后得率增加緩慢，與艾葉揮發(fā)油不斷蒸出后含量的減少有關(guān)。

艾葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，揮發(fā)油是其諸多藥理活性的主要有效成分群，艾葉揮發(fā)油質(zhì)量的穩(wěn)定是其藥理活性的保證，因此其提取工藝的研究具有應(yīng)用價(jià)值[20-21]，尤其水蒸氣蒸餾法提取，環(huán)保、經(jīng)濟(jì)，適合推廣。

[1] 宋川.艾葉生藥及其化學(xué)成分研究[D].昆明：云南中醫(yī)學(xué)院，2013.

[2] 段蓉.艾葉化學(xué)成分的提取、分離與含量測(cè)定研究[D].天津：天津中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[3] 吉雙，張予川，刁云鵬，等.艾葉的化學(xué)成分[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（8）：617-619.

[4] 劉先華，周安，劉碧山，等.艾葉揮發(fā)油體內(nèi)外抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（8）：25-26.

[5] 侯迎迎.艾葉乙酸乙酯部位抗乙肝病毒活性研究及成分分析[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2013.

[6] 程慧.艾葉中黃酮類化合物研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2014，29（9）：2015-2016.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：83.

[8] 梅全喜，高玉橋.艾葉化學(xué)及藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2006，28（7）：1030-1032.

[9] 張?jiān)?，張琳，倪娜，?艾葉的體外凝血作用實(shí)驗(yàn)研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（2）：156-157.

[10] 費(fèi)新應(yīng)，余珊珊，韋媛，等.蘄艾提取液抑制免疫性肝損傷大鼠肝纖維化作用的觀察[J].實(shí)用肝臟病雜志，2009，12（1）：11-13.

[11] 周英棟，費(fèi)新應(yīng).艾葉的藥理作用研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2010，32（11）：75.

[12] 趙志鴻，黃勇勇，張小俊，等.河南駐馬店產(chǎn)艾葉揮發(fā)油的GC-MS 分析[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2013，45（2）：80-84.

[13] 劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27（9）：52-55.

[14] 姜麗紅，田汝芳，馬宏偉，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選藏茵香揮發(fā)油的提取與包合工藝[J].中藥工藝與制劑，2014，25（23）：2139-2140.

[15] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄63.

[16] 方積乾.生物醫(yī)學(xué)研究的統(tǒng)計(jì)方法[M].北京：高等教育出版社，2007：541-553.

[17] 李艷玲，范艷花，陶偌偈.SPSS16.0 軟件在化學(xué)正交試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].化學(xué)教學(xué)，2011，6（1）：17-19.

[18] 溫悅.揮發(fā)油提取方法研究概況[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19（12）：84-85.

[19] 張麗珍，詹曉如，胡奕勤，等.四味清口含片中揮發(fā)油的微波-超聲輔助協(xié)同提取工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（35）：27-30.

[20] 張小俊，趙志鴻，張壯麗，等.艾葉頂空萃取的揮發(fā)油指紋圖譜[J].中成藥，2014，36（6）：1222-1249.

[21] 王緒穎，陳彥，張振海，等.化學(xué)與藥效學(xué)指標(biāo)相結(jié)合改進(jìn)痛經(jīng)寶顆粒中揮發(fā)油提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（9）：15-21.