五脈綠絨蒿超臨界二氧化碳萃取工藝及其成分分析

楊仕兵 袁 明 徐達宇 陳湘宏 康文娟

青海大學醫(yī)學院，青海西寧 810001

五脈綠絨蒿Meconopsis quintuplinervia Reg.為罌粟科綠絨蒿屬多年生草本植物，分布于青海、西藏、甘肅、四川等省區(qū)，全草入藥，用于治療肝炎、肺炎、頭痛、水腫等多種疾病[1]。根據(jù)原衛(wèi)生部藥典委員會1995 年《藏藥藥品標準》[2]和國家中醫(yī)藥管理局2002 年《中華本草·藏藥卷》[3]要求，認定“歐貝”系多種綠絨蒿的總稱，為常用珍稀藏藥。據(jù)《藏藥志》的記載，五脈綠絨蒿為藏藥“歐貝”的正品資源種類，性甘、澀、涼，具有清熱解毒、利尿、消炎、止痛的功效，可用于治療肺炎、肝炎、頭痛、水腫、皮膚病、肝和肺的熱癥等疾??；其花的解熱效果好，并能治療血熱和血旺[4-5]。 五脈綠絨蒿化學成分的研究始于20 世紀80 年代，有關(guān)五脈綠絨蒿化學成分的研究報道多限于生物堿和黃酮類[6-8]。 目前，藥材中揮發(fā)性成分常見的提取方法是采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，該法具有提取效率高、操作簡便等優(yōu)點，然而其提取溫度較高，一些遇熱不穩(wěn)定的化學成分可能會發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，引起揮發(fā)性成分的變質(zhì)[9]。超臨界二氧化碳（CO2）萃取技術(shù)是近年來飛速發(fā)展的一項新型分離萃取技術(shù)，與傳統(tǒng)的萃取方法相比，超臨界CO2萃取大大簡化了提取過程，具有步驟少、耗時短、安全環(huán)保、提取溫度低、提取率高、無溶劑殘留等優(yōu)勢，如果條件控制得當，還直接分離得到目標產(chǎn)物[10]。

超臨界CO2萃取技術(shù)是目前應(yīng)用較廣的一種中藥深加工技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取[11-18]，但應(yīng)用超臨界CO2萃取技術(shù)提取五脈綠絨蒿的揮發(fā)性成分的工藝尚未見報道。為了考察五脈綠絨蒿超臨界CO2萃取揮發(fā)性成分的提取工藝及化學成分，本研究應(yīng)用超臨界CO2萃取技術(shù)對五脈綠絨蒿揮發(fā)油部分進行萃取，采用正交試驗，考察萃取壓力、萃取溫度和CO2流量三因素對五脈綠絨蒿超臨界CO2萃取物得率的影響，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析萃取物的化學成分，用峰面積歸一法測定各化合物的相對含量，為進一步評價五脈綠絨蒿的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超臨界CO2萃取儀（SFT-100）：美國SFT 公司提供；GC6890N/MSD5973N 聯(lián)用儀。

1.2 試藥

五脈綠絨蒿藥材（青海門源縣產(chǎn)，經(jīng)青海大學醫(yī)學院藥學系中藥學教研室鑒定為罌粟科綠絨蒿屬植物五脈綠絨蒿），CO2（純度＞99.999%，北京醫(yī)用氣體公司提供）。

2 方法

2.1 超臨界CO2 萃取流程

將藥材投入萃取釜中，對萃取釜、分離釜、貯罐分別進行加熱或冷卻，當系統(tǒng)各部分達到設(shè)定溫度后，開啟CO2鋼瓶，CO2氣體增壓泵增壓進入萃取釜，升壓到預(yù)定設(shè)置值，使CO2成超臨界流體，對五脈綠絨蒿中的揮發(fā)性成分進行萃取。

2.2 正交試驗設(shè)計

將粉碎的五脈綠絨蒿10 g 放入萃取釜中，按“2.1”所述的方法進行萃取。 以五脈綠絨蒿藥材的萃取率為考核指標， 以影響其萃取率的三個因素變量（壓強、溫度、時間），設(shè)計三水平三因素的正交試驗表L9（33）。 見表1。

表1 超臨界二氧化碳萃取五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分正交試驗設(shè)計表

2.3 低極性組分的分離

將萃取物采用濕法上樣的方法上硅膠柱，選用200～300 目的硅膠進行柱層析，以石油醚（30～60℃）為流動相沖柱按極性由小到大以此得到組分A 和組分B。

2.4 萃取物的GC-MS 分析

測試條件：GC 汽化室溫度250℃，HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，50℃恒溫2 min，然后以4℃/min 的升溫速率由80℃程序升溫至290℃，恒溫30 min，載氣為99.999%高純氦。

MSD 離子源為EI 源，離子源溫度230℃，電子能量70 eV；使用美國NIST05 譜庫。

3 結(jié)果

3.1 超臨界CO2 萃取實驗結(jié)果

超臨界CO2萃取實驗結(jié)果見表2。

表2 超臨界二氧化碳萃取五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分正交試驗結(jié)果

3.2 影響因素分析

極差的大小直接反映了各個因素對試驗指標影響的變化幅度，極差大表明該因素的影響越大，是主要因素；反之，極差小則表明該因素的作用不大，屬于次級因素。 因此，可以通過比較各個因素的極差大小決定因素的主次順序。 本試驗由表2 觀察極差R 值可知，萃取壓力、萃取溫度、萃取時間三因素的極差分別為0.220、0.040、0.184，表明萃取壓力對萃取物含量的影響最顯著，三因素對萃取率的影響順序為萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度； 觀察三因素不同水平的K值可知，萃取 壓力：K2＞K3＞K1，萃取溫 度：K3＞K2＞K1，萃取時間：K3＞K2＞K1，因此，五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分超臨界CO2萃取的最佳工藝條件為：萃取壓力25 mPa，萃取溫度45℃，萃取時間2.5 h。 本文采用該組合條件進行了萃取試驗，存此條件下五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分的萃取率可達1.245%。

極差分析簡單明了，但無法估計試驗誤差的大小，為了彌補極差分析的缺陷，又采用了方差分析，方差分析提出了一個標準來判斷所考察因素作用是否顯著，但是方差檢驗靈敏度很低，有時即使因素對試驗指標有影響，方差檢驗也判斷不出來，所以方差分析的結(jié)果沒有顯著性影響，不代表沒有影響。 對上述正交試驗結(jié)果采取方差分析（表3），以離差平方和最小的因素作誤差分析其他因子的顯著性， 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間的顯著性檢驗分析系顯示，P 值分別為0.010（＜0.05）、0.222（＞0.10）、0.021（＜0.05），表明萃取壓力對萃取率的影響最顯著，其次為萃取時間，萃取溫度對萃取率的影響最小，顯示了方差分析的結(jié)果與極差分析的結(jié)果一致。

表3 超臨界二氧化碳萃取五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分正交試驗方差分析

3.3 超臨界CO2 萃取五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分的GC-MS分析

按上述實驗條件，分別對組分A 和組分B 進行分析，得其總離子流（圖1、2），對總粒子流圖中的各峰經(jīng)過系統(tǒng)檢索及人工圖譜解析，確定了兩組分的主要化學成分，通過NIST 庫檢索一共鑒定出66 個化合物的具體結(jié)構(gòu)，其中正十六烷酸、亞油酸、正二十九烷、新植二烯、芳樟醇等在該藥材萃取物中占的比例較高，結(jié)果見表4、5。

圖1 五脈綠絨蒿超臨界二氧化碳萃取分離組分A 總粒子流圖

圖2 五脈綠絨蒿超臨界二氧化碳萃取分離組分B 總粒子流圖

表4 五脈綠絨蒿超臨界二氧化碳萃取分離組分A 化學成分分析結(jié)果

表5 五脈綠絨蒿超臨界CO2 萃取分離組分B 化學成分分析結(jié)果

4 討論

超臨界萃取技術(shù)是一種集提取、分離、濃縮為一體的較新型的萃取分離技術(shù)，該技術(shù)具有工藝過程簡單、選擇性強、無溶劑殘留、物質(zhì)活性無破壞等優(yōu)勢。影響超臨界萃取的因素主要與萃取壓力、溫度和萃取時間有關(guān)。其中壓力是超臨界CO2萃取中最重要的因素之一，當達到一定溫度時，隨著萃取壓力的升高，超臨界CO2流體的密度和極性增加，溶解能力也相應(yīng)增加，因此萃取率隨之增加。在大多數(shù)情況下，對極性物質(zhì)的分離，還需要使用夾帶劑，主要目的是為了增加目標產(chǎn)物的溶解度，常用的夾帶劑為甲醇或乙醇，甲醇的溶解性能比乙醇好，作為夾帶劑應(yīng)優(yōu)于乙醇。本實驗中，考慮的萃取溫度較好，因甲醇揮發(fā)性產(chǎn)生較大危害，故沒有使用。 此外，原料粒度、CO2流量等均影響萃取率。本研究利用正交試驗法優(yōu)化五脈綠絨蒿萃取脂溶性成分的工藝，以壓力、溫度和時間為因素進行三因素三水平正交試驗設(shè)計，從萃取率與各因素的關(guān)系分析表明，對五脈綠絨蒿萃取率的影響程度從大到小依次為萃取壓力、萃取時間、萃取溫度。顯著性分析表明，壓力與時間均表現(xiàn)為顯著。 因此，本實驗所確定的五脈綠絨蒿最佳萃取條件可靠，正交試驗設(shè)計合理。

GC-MS 分析技術(shù)廣泛用于中藥揮發(fā)性成分的研究，對于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究具有極其重要的作用[19]。 萃取物中共鑒定了66 個化合物，占總化合物的97%，本文所鑒定的化合物，與文獻[20]報道的采用水蒸氣提取的結(jié)果存在較大差異，從鑒定出來的化合物種類、化合物的相對含量和總提取率均可看出，超臨界CO2萃取與傳統(tǒng)水蒸氣提取兩者在含量上存在明顯差異，這種差異與超臨界CO2萃取技術(shù)所具有的特點有關(guān)。超臨界CO2萃取時，CO2在增壓過程中流體相對接近液體的密度和相對接近氣體的黏度，使它具有較好的流動性和較高的溶解度，此狀態(tài)下的擴散系數(shù)使其對所萃取的物質(zhì)組織具有很好的滲透性，從而能將藥材中所含的各組分有效地提取出來，超臨界CO2萃取五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分，萃取溫度低，可大量保存對熱不穩(wěn)定及易氧化的揮發(fā)性成分，操作過程中可以通過調(diào)節(jié)壓力和溫度進行選擇性的萃取和分離，因此超臨界CO2萃取揮發(fā)性成分具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的水蒸氣提取揮發(fā)油時，由于有些物質(zhì)相對分子量較大，沸點較高，揮發(fā)性小而難于提取出來，再加上高溫使一些化合物分解而破壞，無法提取出原有的天然化合物。此外，藥材的產(chǎn)地、采收及貯存等各個方面均會影響到化學成分的構(gòu)成與含量。

在實際工業(yè)生產(chǎn)中，對于主要因素一定要選取最優(yōu)水平，對于次要因素，則應(yīng)權(quán)衡利弊，綜合考慮成本、勞務(wù)條件等來選取水平，從而得到最符合生產(chǎn)實際的最佳工藝。相關(guān)五脈綠絨蒿揮發(fā)性成分與不同產(chǎn)地、不同物候期、不同提取方法的關(guān)系還有待于進一步深入研究，本研究結(jié)果可為五脈綠絨蒿的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

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