大孔吸附樹脂制備尾葉香茶菜總二萜的工藝研究

馬瑞麗， 李 敏， 徐秀泉， 王云麗， 湯 建*， 陳海生

(1.江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.上海第二軍醫(yī)大學藥學院， 上海 200433)

尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.)Hara，又名龜葉草、狗日草、野蘇子，為唇形科香茶菜屬植物，多產(chǎn)于我國東北及朝鮮的山區(qū)。性涼味甘，民間用于治療胃炎，膀胱脹痛，癌癥，感冒發(fā)熱等[1-2]。尾葉香茶菜二萜類成分具有良好的抗癌、抑制酪氨酸酶、抗氧化等活性[3-5]，其中主要成分尾葉香茶菜丙素(kamebakaurin, KA) 因其顯著的抗炎免疫、神經(jīng)保護和抗腫瘤活性而備受關注[6-8]。但目前尾葉香茶菜丙素及結構類似物主要通過植物提取方法制得，且藥材中二萜類化合物種類多而含有量不高[4, 9]，因此，選取一條高效制備總二萜的工藝對于尾葉香茶菜丙素等二萜化合物的結構改造、活性篩選以及作用機制等深入研究至關重要。

大孔吸附樹脂是上世紀60年代發(fā)展起來的分離技術，因其理化性質穩(wěn)定，分離純化有效成分性能優(yōu)異，在中藥生產(chǎn)過程中使用廣泛[10-11]。目前已有利用AB-8、D101等大孔吸附樹脂富集、純化二萜類成分的報道[5, 12]，但在前期研究中發(fā)現(xiàn)，以尾葉香茶菜地上部分為原料制備總二萜，提取物中雜質較多，含有大量的色素，影響到總二萜的活性評價和化合物的分離純化。本實驗考察不同大孔樹脂、不同吸附、解析條件等工藝參數(shù)，優(yōu)化制備尾葉香茶菜總二萜的流程，以期建立規(guī)?；苽湮踩~香茶菜總二萜的生產(chǎn)工藝。

1 儀器與材料

R-21旋轉蒸發(fā)儀(BUCHI)，LC-20A高效液相色譜儀(SHIMADZU)；ZF-300超聲波清洗機；Sartorius電子天平；PCS型紫外-可見分光光度計；液相用色譜純甲醇，雙純水；樹脂柱洗脫用去離子水和90%乙醇。HPD400和HPD826(滄州寶恩)，AB-8和D101樹脂(天津南開)，HP 20(日本三菱)，XAD16N和XAD7HP (上海陶氏化學)。

藥材采自吉林長白山區(qū)，經(jīng)本院歐陽臻教授鑒定為尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.)Hara。尾葉香茶菜丙素(KA)對照品由本室自制，經(jīng)面積歸一化法檢測純度98.6%，滿足實驗要求。

2 方法與結果

2.1 分析方法

2.1.1 HPLC測定尾葉香茶菜丙素 精密稱取干燥的尾葉香茶菜丙素10.02 mg置于50 mL量瓶，用95%乙醇溶解并定容，制成質量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。將原液依次稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的梯度濃度溶液，分別取上述對照品溶液20 μL進行測定。以對照品進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=14 079X+4 938.3，r2=0.999 9，在3.125～100.0 μg/mL間呈良好線性關系[13]。

Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動相為甲醇-水(等度洗脫，50∶50)；體積流量0.8 mL/min；檢測波長235 nm。對照品及樣品依上述條件檢測，HPLC圖如圖1。

圖1 尾葉香茶菜丙素(KA)對照品(A)(0.05 mg/mL)和樣品(B)(1.0 mg/mL)HPLC圖

2.1.2 UV法測定總二萜的量 分別精密吸取對照品溶液(0.5 mg/mL) 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL至量瓶中，定容至10 mL，在最大吸收波長235 nm處測吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程Y=44.039X-0.698 7，r=0.999 7，在5.0～30.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 藥材吸附液的制備 尾葉香茶菜75%甲醇提取物浸膏，先用少量乙醇溶解，再加熱水，配置所需濃度的吸附溶液。

2.3 樹脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附試驗 精密稱取預處理過的大孔樹脂1.0 g，分別加入20 mL吸附液，搖床振搖24 h，使充分吸附。紫外和HPLC兩種檢測方法，計算各種樹脂吸附量。7種樹脂的吸附量如表1。

表1 不同樹脂對總二萜和尾葉香茶菜丙素的靜態(tài)吸附量及解析率(n=3)

2.3.2 靜態(tài)解析試驗 D101、HP20和XAD16N 3種樹脂各3份(1.0 g)至于錐形瓶中，加入20 mL 1.0 mg/mL提取液使其振蕩24 h，充分吸收后將液體抽濾，向其中各加入20 mL 70%、80%、90%、95% 乙醇，振搖24 h，使其充分解析。發(fā)現(xiàn)3種樹脂都是95%乙醇解析率最高。故選用95%的乙醇考察7種樹脂的靜態(tài)解析率。上述7種樹脂充分吸收樣品后將液體抽濾，樹脂分別加入20 mL 95%乙醇，振搖24 h，使其充分解吸。7種樹脂的解析率見表1。

根據(jù)表1可知，XAD16N、HP20和HPD826樹脂具有較高的吸附率，但HPD826樹脂對總二萜的解析率較低，對尾葉香茶菜丙素的解析率也低于XAD16N和HP20樹脂。綜合考慮，選用XAD16N和HP20樹脂進行動態(tài)吸附劑解析試驗。

2.3.3 動態(tài)吸附及解析試驗 XAD16N和HP20樹脂各取25 g(約50 mL)，置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。取50 mL質量濃度為10 mg/mL吸附液 (為提高其濃度，加熱至60 ℃) 加于柱頂，流出液再上柱重新吸附，靜置12 h后用水洗脫3 BV，再改用95%乙醇洗至無二萜類化合物流出。XAD16N樹脂和HP 20樹脂對總二萜和尾葉香茶菜丙素的動態(tài)吸附量和解析率見表2?？紤]技術及經(jīng)濟因素，選用XAD16N樹脂經(jīng)行尾葉香茶菜總二萜制備的工藝研究。

表2 兩種樹脂對總二萜和尾葉香茶菜丙素的動態(tài)吸附量及解析率(n=3)

2.4 XAD16N樹脂純化總二萜的工藝優(yōu)化

2.4.1 吸附液質量濃度的考察 將質量濃度為25 mg/mL(70 ℃)的提取液分別在60 ℃下稀釋至10、5、2.5、1.25 mg/mL。5種質量濃度的吸附液以2 BV/h的體積流量進行動態(tài)吸附，用5 BV水以同樣體積流量洗脫，再以95%乙醇以2 BV/h的體積流量洗脫，收集洗脫液，測定吸光度，實驗重復3次，計算吸附率(圖2)。

圖2 吸附液質量濃度對動態(tài)吸附率的影響

從圖2可以看出，若質量濃度較低，目標成分吸附較慢，部分化合物隨液體流出；若吸附質量液濃度太大總二萜吸附率也不高，可能是因為質量濃度偏高而化合物傳輸受阻，且局部過載，部分化合物隨洗脫液流出。因此，吸附液質量濃度選擇10 mg/mL。

2.4.2 動態(tài)吸附泄漏曲線 XAD16N樹脂25 g(約50 mL)，置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。取100 mL質量濃度為10 mg/mL(60 ℃)吸附液加于柱頂，以2 BV/h的體積流量進行動態(tài)吸附，流出液每10 mL收集一次，測其紫外吸光度和尾葉香茶菜丙素量，以收集液體積為橫坐標，流出液中未吸附化合物比率為縱坐標繪制泄漏曲線(圖3)。XAD16N樹脂的總二萜和尾葉香茶菜丙素泄漏曲線趨勢相似，尾葉香茶菜丙素在50 mL以前吸附率略高于總二萜類化合物，50 mL后吸附率略低于總二萜類成分，且70 mL后基本不再吸附，而總二萜類組分是80 mL后達到吸附飽和狀態(tài)。

圖3 XAD16N樹脂的泄漏曲線

2.4.3 吸附體積流量的考察 3份XAD16N樹脂25 g(約50 mL)，分別置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。以不同的體積流量加入10 mg/mL吸附液(60 ℃)50 mL：1、2、4 BV/h。其總二萜吸附量分別是 7.9、7.6和6.6 mg/g，KA吸附量分別是2.2、2.2和2.0 mg/g。綜合考慮吸附率和時間成本，選用2 BV/h流量。

2.4.4 洗脫用水pH的考察[14]吸附液上樣到XAD16N樹脂，其完全吸附后分別用pH為7、8、9、10的NaOH水溶液及pH為9的10%的乙醇進行洗脫，除去色素。洗至無色后用95%乙醇洗下目標組分，濃縮后配置成原來體積，在250 nm測其A值，實驗重復3次。根據(jù)公式：脫色率(%)=(A前-A后)/A前計算脫色率，A前為脫色前溶液在最大吸收波長330 nm處的A值，A后為脫色后溶液在最大吸收波長250 nm處A值。pH對脫色率的影響見圖4。雖然pH為9的15%乙醇脫色率高于pH 9的水溶液，但易洗脫出二萜化合物，故選擇pH 9的堿水脫色。

圖4 洗脫劑pH對解析率的影響

2.4.5 洗脫劑體積流量考察 取“2.4.3”項中的3份樣品，先以pH 9的NaOH水溶液洗至洗脫液顏色不再變淺，再用2 BV 95%乙醇分別在2、4、6 BV/h流量下洗脫。解析度分別為98% (KA: 99%)、95% (KA: 96%)和86%(KA: 88%)。綜合考慮洗脫時間、試劑和解析率，選用4 BV/h體積流量考察動態(tài)解析曲線。

2.4.6 動態(tài)解析曲線考察 最優(yōu)動態(tài)吸附條件上柱，充分吸收后用pH 9的NaOH水溶液洗至洗脫液顏色不再變淺，再用95%乙醇分別在4 BV/h流量下洗脫。每10 mL收集一次洗脫液，測定吸光度，繪制樹脂的動態(tài)解吸曲線。見圖5。洗脫液用量為4 BV時，能夠基本解析全部總二萜類成分。

圖5 動態(tài)解析曲線

2.5 工藝穩(wěn)定性驗證試驗 實驗表明XAD16N樹脂制備尾葉香茶菜總二萜的最優(yōu)工藝條件是吸附溶液質量濃度為10 mg/mL(60 ℃)，吸附液與樹脂的比例2∶1(V/m)，吸附流量2 BV/h，脫色時水pH 9，95%乙醇解析體積流量4 BV/h，用量4 BV。采用最優(yōu)工藝條件進行平行實驗3次。

所得結果見表3，XAD16N樹脂制備尾葉香茶菜二萜具有良好的穩(wěn)定性。所得樣品經(jīng)參照“2.1.2”項條件HPLC分析，與圖1相比，尾葉香茶菜丙素明顯得到富集，見圖6。

表3 工藝穩(wěn)定性實驗結果

圖6 產(chǎn)品中尾葉香茶菜丙素(KA)HPLC圖譜

3 討論

本實驗對7種不同大孔吸附樹脂純化尾葉香茶菜總二萜的性能進行了研究，綜合考慮技術及經(jīng)濟因素，選擇XAD16N樹脂用于制備尾葉香茶菜總二萜的工藝研究。針對XAD16N大孔吸附樹脂進行了吸附、解析以及脫色工藝條件的優(yōu)化，在優(yōu)選條件下，通過XAD16N樹脂制得的產(chǎn)品中二萜類成分的量為52%，其中尾葉香茶菜丙素(KA)的量為8.8%，約為藥材中的100倍。該工藝簡單穩(wěn)定，純化效果好，成本較低，具有規(guī)?；瘧脙r值，為后續(xù)制備較高純度尾葉香茶菜總二萜和精制尾葉香茶菜丙素打下了重要基礎。

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