細(xì)柱五加葉中色素的超聲輔助提取工藝及其體外實(shí)驗(yàn)研究

劉恒言，李芝，劉向前, ，戴玲，鄒親朋

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙，410208；2. 中南大學(xué) 制藥工程系，湖南 長沙，410083)

色素是食品加工生產(chǎn)中必不可少的原料，主要分為人工合成色素和天然色素兩大類。近二十年來由于合成色素的毒性不斷被發(fā)現(xiàn)，特別是蘇丹紅等食品色素問題的出現(xiàn)，合成色素的使用日趨減少。與人工合成色素相比，天然色素來源于生物體，著色自然，安全性相對(duì)較高，加之其本身亦具有一定的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，已廣泛應(yīng)用于食品加工中[1]。然而，食品安全越來越受到全社會(huì)的關(guān)注，為了保證食品安全，在天然色素添加劑的研制開發(fā)、加工及與食品的配合應(yīng)用過程中必須加強(qiáng)它的活性及毒性研究，保證其使用安全，如具有抗炎作用的姜黃素[2]、茶色素[3]等天然色素在使用時(shí)也存在安全隱患，都必須嚴(yán)格注意。天然色素的穩(wěn)定性較差，為保持其生理活性，提取時(shí)一般應(yīng)使用較為溫和的工藝條件。超聲波是一種彈性波，能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，方向性好，穿透能力強(qiáng)，停留時(shí)間長，用于固液提取過程可使細(xì)胞周圍和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)流，從而提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，有利于植物中有效成分的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散及提取[4]。采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法需要耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑和時(shí)間才能提取完全，而超聲波在溶劑中產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用等可提高提取率，有效縮短提取時(shí)間，具有明顯優(yōu)勢[5-7]。響應(yīng)面分析方法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法，克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷[8-10]。細(xì)柱五加(Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)是五加科(Araliaceae)五加屬植物，主要分布于我國湖南、安徽、湖北等地，以根皮入藥，歷次《中國藥典》均以“五加皮”收載，具有祛風(fēng)除濕，強(qiáng)壯筋骨，活血去瘀，利水消腫的功效[11]。近年來國內(nèi)外正全方位開發(fā)該屬植物，包括根、莖、葉和果實(shí)等，研究發(fā)現(xiàn)該屬植物中含有三萜類、黃酮類、多糖等多種生理活性物質(zhì)[12-18]，被廣泛的作為香料和醫(yī)藥品開發(fā)。然而在提取分離這些生理活性物質(zhì)時(shí)，通常將石油醚萃取部位的色素丟棄。若能在提取活性物質(zhì)的同時(shí)將色素提取分離，既能避免資源浪費(fèi)，又能帶來一定的經(jīng)濟(jì)利益。孫海濤等[19]對(duì)安全性高、色調(diào)柔合并具有一定營養(yǎng)、保健作用的刺五加漿果色素的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅大幅度提高長白山野生刺五加的附加值，更解決其果渣浪費(fèi)的問題；馮穎等[20-21]對(duì)無梗五加果色素進(jìn)行提取及穩(wěn)定性研究，旨為找出影響五加果色素穩(wěn)定性的因素，采取相應(yīng)的方法提高其穩(wěn)定性，為五加果色素應(yīng)用提供一定的合理建議和方法，加快五加果天然色素的市場應(yīng)用。本文作者采用超聲波提取法輔助提取細(xì)柱五加葉色素，以響應(yīng)面法確定其最佳提取工藝；并采用MTT 法測定色素總提取物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞毒性作用以及對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞株炎癥模型反應(yīng)中細(xì)胞上清液的NO 含量影響。以期為安全、綜合利用五加科植物資源提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥與儀器

試藥有：細(xì)柱五加葉，2011 年8 月采于湖南長沙，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉向前鑒定為 A.gracilistylus W. W. Smith 的葉，經(jīng)干燥，粉碎，過孔徑365 μm 篩備用，標(biāo)本存放于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室(標(biāo)本號(hào)為110829)；95%乙醇、石油醚(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，丙酮、氯仿(長沙湘科精細(xì)化工廠)，蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)，所有試劑均為分析純；RAW 264.7 巨噬細(xì)胞株由韓國細(xì)胞株銀行供應(yīng)，DMEM 培養(yǎng)基、新生牛血清(FCS)(美國Invitrogen 公司)，青鏈霉素、胰酶、MTT 細(xì)胞毒性分析試劑盒(美國Life Technologies, Grand Island公司)，Griess試劑(美國Sigma 公司)。

儀器有：KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；循環(huán)水式真空泵、RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司)；FA-2104 電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV-1750 型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；超凈工作臺(tái)(美國LABCONCO 公司)；Eppendorf離心機(jī)、低溫離心機(jī)(德國Beckman 公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱、-70 ℃超低溫冰箱(美國Thermo 公司)，Olympus 顯微鏡(日本理光)，96 孔板(美國Corning公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

取干燥細(xì)柱五加葉約20 g，精密稱定，分別以料液比1:10 (g:mL)加入氯仿、丙酮、石油醚、95%乙醇、80%丙酮溶液，在溫度45 ℃，超聲功率180 W，頻率40 kHz 的條件下連續(xù)提取3 次，每次15 min，抽濾、濃縮至浸膏、95%乙醇溶解定容至1 000 mL，精密吸取20 mL 再稀釋至100 mL(避光條件下進(jìn)行)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

取干燥細(xì)柱五加葉約20 g，精密稱定，以95%乙醇作為提取溶劑，按照各種不同條件(液料比、超聲波功率、提取次數(shù)、溫度、提取時(shí)間)進(jìn)行超聲波提取，抽濾，濾渣經(jīng)95%乙醇多次洗滌后合并濾液，濃縮得醇提浸膏，石油醚萃取，濃縮得石油醚浸膏(避光條件下進(jìn)行)。

(1) 料液比。料液比分別為1:6，1:8，1:10，1:12和1:14，超聲功率為160 W、頻率為40 kHz、溫度為45 ℃的條件下提取3 次，每次20 min，比較不同料液比對(duì)色素提取率的影響。

(2) 超聲時(shí)間。在料液比為1:10、超聲功率為160 W、頻率為40 kHz、溫度為45 ℃的條件下分別以提取時(shí)間10，15，20，25 和30 min 提取3 次，比較提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響。

(3) 提取次數(shù)。在料液比為1:10、超聲功率為160 W、頻率為40 kHz、溫度為45 ℃的條件下分別提取1，2，3，4 和5 次，每次20 min，比較提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響。

(4) 超聲功率。在料液比為1:10、超聲功率分別為80，100，120，140 和160 W，頻率為40 kHz、溫度為45 ℃條件下提取3 次，每次20 min，比較超聲功率對(duì)色素提取率的影響。

(5) 超聲溫度。在料液比為1:10、超聲功率為160 W，頻率為40 kHz，溫度分別為40，45，50，60 和70 ℃的條件下提取3 次，每次20 min，比較提取溫度對(duì)色素提取率的影響。

1.2.3 細(xì)柱五加葉提取液中的色素濃度測定和提取率計(jì)算

從1.2.2 中得到的浸膏用95%乙醇溶解并定容至1 000 mL，然后從中吸取20 mL，以95%乙醇定容至100 mL，最后以葉綠體色素為標(biāo)準(zhǔn)，95%乙醇溶液為參比液，運(yùn)用修正的Arnon 法[22-24]可見分光光度法測定其在指定波長處(波長665，649 和470 nm)的吸收度，通過計(jì)算得出溶液的色素含量及細(xì)柱五加葉色素的提取率。細(xì)柱五加葉色素提取液的色素質(zhì)量濃度和提取率按下式計(jì)算：

式中：ρa(bǔ)，ρb和ρx+c分別為葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素的質(zhì)量濃度，μg/mL；Y 為細(xì)柱五加葉色素提取率，%，；M 為細(xì)柱五加葉粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的選擇

圖1 所示為不同溶劑對(duì)細(xì)柱五加葉色素的超聲提取的影響。由圖1 可知：不同溶劑對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率由高到低依次為：95%乙醇、80%丙酮、丙酮、氯仿、石油醚。95%乙醇較其他溶劑提取率高，安全、危害性小，價(jià)格便宜且易于生產(chǎn)。綜合經(jīng)濟(jì)、環(huán)境、安全、效率等多方面考慮，本實(shí)驗(yàn)選取95%乙醇作為細(xì)柱五加葉色素超聲提取的提取溶劑。

2.1.2 提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響

圖2 所示為提取次數(shù)對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響。由圖2 可知：在相同條件下提取3 次的提取率最高，次數(shù)增多且出現(xiàn)提取率下降的趨勢，說明隨著提取次數(shù)的增多，色素分子可能在提取處理過程中被氧化破壞，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。所以在相同條件下對(duì)細(xì)柱五加葉色素的超聲提取以提取3 次最合適。

圖1 不同溶劑對(duì)細(xì)柱五加葉色素的超聲提取的影響Fig.1 Effect of solvent on extraction rate of pigments

圖2 提取次數(shù)對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響Fig.2 Effect of extracting times on extraction rate of pigments

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響

圖3 所示為提取時(shí)間對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響。由圖3 可知：細(xì)柱五加葉色素的超聲提取率與提取時(shí)間成正比，提取時(shí)間越長，色素的提取率就越高，說明提取時(shí)間也是色素提取的一個(gè)重要影響因素。但提取時(shí)間在15 min 以下時(shí)提取率隨時(shí)間增加的幅度大，在15 min 以上時(shí)增幅明顯減小，25 min 以后提取率基本不變。主要原因是超聲波提取時(shí)間過短，不能有效地破壞細(xì)柱五加葉的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使色素有效的溶出，而在長時(shí)間的超聲作用下色素有可能會(huì)因氧化而逐漸分解，造成損失。所以超聲提取時(shí)間以20 min 為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on extraction rate of pigments

2.1.4 料液比對(duì)色素的提取率的影響

圖4 所示為料液比對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響。由圖4 可知：料液比對(duì)細(xì)柱五加葉色素提取率的影響不大，在料液比為1:10 時(shí)細(xì)柱五加葉色素的提取率最高，證明此時(shí)細(xì)柱五加葉色素已被全部提取出來。理論上此時(shí)隨著料液比增大，溶解出的色素量應(yīng)該不變，細(xì)柱五加葉色素的提取率也應(yīng)為恒值，但在整個(gè)提取過程中料液比越大，色素與光、氧氣、熱等致使其變性的因素接觸的機(jī)會(huì)也越大，使得損失也越大，所以色素提取率在料液比大于1:10時(shí)有下降趨勢。因此，以料液比1:10 時(shí)超聲提取細(xì)柱五加葉的色素最合適。

圖4 料液比對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate of pigments

2.1.5 超聲功率對(duì)色素提取率的影響

圖5 所示為超聲功率對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響。由圖5 可知：超聲波功率在120 W 時(shí)細(xì)柱五加葉色素的超聲提取率最高，超聲功率在120 W 以下時(shí)色素的提取率隨超聲功率的增加而增加，在140 W以上時(shí)則隨超聲功率的增加而減小。原因可能是當(dāng)超聲波功率太低時(shí)，超聲波的空化作用和局部高溫太弱，不能有效破壞細(xì)柱五加葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使色素提取不完全：但功率太高時(shí)超聲波可能會(huì)造成色素的降解，使細(xì)柱五加葉色素含量下降，進(jìn)而使其提取率下降。說明超聲功率也是影響細(xì)柱五加葉色素提取率的因素之一，而相同條件下超聲功率120 W 時(shí)提取細(xì)柱五加葉色素最適合。

2.1.6 提取溫度對(duì)色素的提取率的影響

圖5 超聲功率對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響Fig.5 Effect of power on extraction rate of pigments

圖6 提取溫度對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on extraction rate of pigments

圖6 所示為提取溫度對(duì)細(xì)柱五加葉色素的提取率的影響。由圖6 可知：提取溫度為30～60 ℃時(shí)，色素提取率隨著溫度升高，而逐漸上升；在60 ℃時(shí)其提取率達(dá)到最高。其原因可能是細(xì)柱五加葉的色素主要存在于葉綠體和液泡中，隨溫度升高溶劑的滲透力也不斷升高，溶劑更易透過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。雖然，一般情況下物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增加的，但有研究表明提取溫度過高可能使色素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溫度越高，越容易變性，而在50～70 ℃時(shí)較為穩(wěn)定[25]。這說明提取溫度是色素提取的重要影響因素之一。從圖6 可見：提取溫度為60 ℃時(shí)超聲提取細(xì)柱五加葉色素最適合，提取溫度過高則可能引起葉綠素的分解或變性，從而導(dǎo)致提取率的下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化細(xì)柱五加葉色素超聲提取工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面分析水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇提取時(shí)間(X1)、超聲功率(X2)和提取溫度(X3)作為自變量，以細(xì)柱五加葉色素的提取率(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平取值見表l。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of experiment of RSM

2.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

以提取時(shí)間(X1)、超聲功率(X2)和提取溫度(X3)為自變量，以細(xì)柱五加葉色素的提取率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對(duì)細(xì)柱五加葉色素提取時(shí)間(X1)，超聲功率(X2)，提取溫度(X3)進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。利用Design Expert 8.0 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到細(xì)柱五加葉色素提取率預(yù)測值(Y)對(duì)編碼自變量X1、X2、X3的二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析(見表3)，結(jié)果表明該回歸模型極顯著(P=0.000 1＜0.01)。回歸模型的決定系數(shù)R=0.994 6，校正決定系數(shù)RAdj=0.987 7，RPred=0.960 3，失擬項(xiàng)P=0.515 9＞0.05 不顯著，信噪比為31.028 遠(yuǎn)大于4，說明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度很高，其響應(yīng)值的變化有99.46%來源于所選變量，即提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率。因此，回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以用該模型分析和預(yù)測超聲波提取細(xì)柱五加葉色素的工藝優(yōu)化。

在回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由F 檢驗(yàn)來判定，概率P 越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。回歸模型中的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均為極顯著，交互項(xiàng)X1X3極顯著，表明各影響因素對(duì)提取率的影響并不是簡單的線性關(guān)系，3 個(gè)因素中對(duì)色素提取率影響作用大小順序?yàn)椋禾崛囟?，超聲時(shí)間，超聲功率。

2.2.4 細(xì)柱五加葉色素超聲提取條件分析與優(yōu)化

多元回歸方程的三維圖及其等高線見圖7～9，通過動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任何兩因素之間交互影響的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并從中確定最佳的水平范圍。響應(yīng)面是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因索所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大，表現(xiàn)為曲面越陡峭。等高線的形狀則可以反映兩兩因素之間交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反。

由圖7～9 的三維圖和等高線可以看出：超聲時(shí)間與提取溫度、超聲時(shí)間與超聲功率對(duì)色素提取率有著顯著的交互作用，而提取溫度和超聲功率對(duì)提取率的交互作用不如前者顯著，各因素與細(xì)柱五加葉色素提取率的關(guān)系均清晰可見。根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 8.0軟件獲得了提取率最高時(shí)的最佳超聲波輔助提取條件：超聲時(shí)間為26.7 min，提取溫度63.4 ℃，超聲功率為128 W。在此優(yōu)化條件下，細(xì)柱五加葉色素提取率理論值為0.3737%?？紤]到實(shí)際操作的情況，在超聲時(shí)間為27 min，提取溫度64 ℃，超聲功率為130 W的條件下，進(jìn)行了5 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，5 次實(shí)驗(yàn)的提取率分別為0.369 7%，0.370 5%，0.371 3%，0.370 8%和0.371 6%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提取率的平均值為0.370 8%，與理論預(yù)測值誤差僅為0.029%，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)較為可信，利用超聲波法提取細(xì)柱五加葉色素具有一定的可行性與應(yīng)用價(jià)值。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

表3 響應(yīng)面二次回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

圖7 提取時(shí)間與超聲功率交互作用對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contours of interrelated influence of time and power to extraction rate of pigments

圖8 提取時(shí)間與溫度交互作用對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contours of interrelated influence of time and temperature to extraction rate of pigments

圖9 超聲功率與溫度交互作用對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface and contours of interrelated influence of power and temperature to extraction rate of pigments

3 體外抗炎活性

取上述細(xì)柱五加葉色素總提取物，測定其對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞毒性作用和對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞中NO 分泌量的影響。

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將凍存的細(xì)胞株解凍后，用含10%新生牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基于5%CO2飽和濕度的37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d 換一次液，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%面積時(shí)，小心吸取培養(yǎng)基，PBS 洗滌，加入胰酶消化，按1:5 左右的比例加培養(yǎng)液吹散傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

3.1.1 MTT 法初篩色素總提取物的細(xì)胞毒性

按MTT 細(xì)胞毒性檢測試劑盒操作。取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 細(xì)胞用胰酶消化后，加入含10%FCS 的DMEM 培養(yǎng)基配成1×106個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，5%CO2飽和濕度的37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，然后換上新鮮培養(yǎng)基100 μL，按梯度濃度將色素總提取物分別加入96 孔板中(復(fù)孔，n=3)，使個(gè)目標(biāo)化合物的最終濃度分別為10，20 和40 μg/mL，并設(shè)立空白對(duì)照。24 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DMSO 全部溶解，終止培養(yǎng)，震蕩反應(yīng)10 min。選擇570 nm 波長比色，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值[26]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析比較，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1.2 抗炎活性試驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 細(xì)胞用胰酶消化后，加入含10%FCS 的DMEM 培養(yǎng)基配成2.5×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞，5%CO2飽和濕度的37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，按梯度濃度將色素總提取物分別加入96 孔板中(復(fù)孔，n=3)，使個(gè)目標(biāo)化合物的最終濃度分別為10，20 和40 μg/mL，并設(shè)立空白對(duì)照。1 h 后，每孔加入10 μL LPS 溶液(0.5 μg/mL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育24 h，然后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μL，加入Griess 試劑，室溫避光孵育10 min，在540 nm下測量其吸光度，檢測NO 濃度[27-28]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析比較，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 活性試驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 對(duì)細(xì)胞存活率的影響

如圖10(a)所示，0～40 μg/mL 質(zhì)量濃度的色素總提取物處理RAW 264.7 細(xì)胞24 h 后，與空白對(duì)照組和LPS 模型組相比，細(xì)胞存活率具有顯著差異(P＜0.05)，說明在0～40 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)色素總提取物RAW 264.7 細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性作用。

3.2.2 對(duì)NO 濃度的影響

如圖10(b)所示，LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 產(chǎn)生大量的NO，LPS 模型組細(xì)胞上清液中NO 濃度與空白對(duì)照組比較顯著提高(P＜0.05)，說明體外炎癥模型建立成功。色素總提取物在10，20 和40 μg/mL 劑量時(shí)對(duì)NO 分泌的抑制率分別為-4.00%，6.13%和38.39%，從不同程度上抑制了細(xì)胞上清液中NO 的分泌，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。

圖10 色素質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞存活率和NO 濃度的影響Fig.10 Influence of pigments mass concentration on cell viability and NO concentration

4 結(jié)論

(1) 將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法結(jié)合對(duì)超聲波提取細(xì)柱五加葉色素工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況，獲得的最佳提取工藝為：在以95%乙醇為提取溶劑、料液比1:10、超聲功率130 W、提取溫度64 ℃、提取時(shí)間27 min 的條件下提取3 次，細(xì)柱五加葉色素的提取率約為0.370 8%。超聲波作為一種輔助提取手段，可有效地縮短提取時(shí)間，減少環(huán)境污染，降低能耗及減少色素?fù)p失，從而能有效地節(jié)約生產(chǎn)成本，是中藥提取工程上值得采取的一種經(jīng)濟(jì)性技術(shù)手段。

(2) 采用響應(yīng)面分析法研究細(xì)柱五加葉色素超聲提取工藝參數(shù)，求得的回歸方程精度高；可以準(zhǔn)確找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，是比較理想的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案的方法之一。

(3) 通過體外炎癥模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)柱五加葉色素從不同程度上抑制了細(xì)胞上清液中NO 的分泌，并呈現(xiàn)出劑量依賴性；另外，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)柱五加葉色素總提取物在一定的劑量范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，該結(jié)果也提示天然色素在使用時(shí)須考慮其安全范圍。

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