藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難機(jī)制研究

曲中原，鄒 翔，龍麗莉，王 超，王雨蒙，王嘉琪

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物所博士后科研工作站，哈爾濱150076;2.齊齊哈爾富拉爾基區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161041;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心，哈爾濱150076)

有絲分裂災(zāi)難(mitotic catastrophe)這一概念最初是在1989年由Molz等人提出，他們?cè)谘芯恳环N對(duì)溫度敏感的裂殖酵母突變體中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂時(shí)因染色體異常分離而死亡[1].從發(fā)現(xiàn)有絲分裂災(zāi)難死亡現(xiàn)象至今已經(jīng)20多年，但是人們對(duì)它的了解還十分有限，其中一個(gè)關(guān)鍵的原因就是對(duì)于有絲分裂災(zāi)難的認(rèn)識(shí)缺乏一致的辨別標(biāo)準(zhǔn).最初一些人認(rèn)為，有絲分裂災(zāi)難不是一種細(xì)胞死亡形式，而是引起細(xì)胞死亡的一種不可逆的中間過(guò)渡狀態(tài)，而最終細(xì)胞死亡是通過(guò)凋亡、壞死或衰老等途徑[2].近年來(lái)隨著深入研究，有絲分裂災(zāi)難越來(lái)越趨向于被認(rèn)為是一種由細(xì)胞損傷和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)異常引起的一種新的細(xì)胞死亡途徑，具體機(jī)制尚在研究和探索中.

1 有絲分裂災(zāi)難的特征

當(dāng)細(xì)胞DNA損傷或紡錘體結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，有絲分裂發(fā)生異常，細(xì)胞無(wú)法完全分裂，導(dǎo)致四倍體或多倍體并伴有細(xì)胞死亡的現(xiàn)象稱之為有絲分裂災(zāi)難[3].與凋亡、壞死或衰老等不同，有絲分裂災(zāi)難死亡的特征主要表現(xiàn)在細(xì)胞死亡發(fā)生在錯(cuò)誤的有絲分裂期間或之后，有絲分裂期異常;細(xì)胞體積變大，形成的巨細(xì)胞中含有兩個(gè)或多個(gè)核和部分凝集的染色質(zhì);DNA多倍化;中心體異常復(fù)制，出現(xiàn)多中心體現(xiàn)象等[4].相關(guān)基因變化表現(xiàn)為G2/M期檢查點(diǎn)和有絲分裂紡錘體組裝相關(guān)蛋白質(zhì)的低表達(dá)或缺失，caspase激活或不激活.檢測(cè)方法主要有光學(xué)顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡或電鏡檢測(cè)細(xì)胞含兩個(gè)或多核.流式細(xì)胞儀檢測(cè)G2/M阻滯，多倍體[5].從這些特征分析有絲分裂災(zāi)難死亡發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂期的不同階段，但主要是長(zhǎng)時(shí)間的中期阻滯所引起.當(dāng)紡錘體檢查點(diǎn)出現(xiàn)異常，損傷的遺傳物質(zhì)異常分配形成多核后，就能啟動(dòng)有絲分裂災(zāi)難死亡通路.

2 有絲分裂災(zāi)難與G2/M期檢查點(diǎn)

研究表明有絲分裂災(zāi)難與G2/M期檢測(cè)點(diǎn)有著密切關(guān)系，G2/M檢測(cè)點(diǎn)異常時(shí)，期細(xì)胞不能正常分裂，導(dǎo)致四倍體或多倍體的形成，細(xì)胞失去活性并伴有死亡現(xiàn)象.

2.1 cdc2/cyclinB1 復(fù)合物

有絲分裂期的啟動(dòng)是由cdc2/cyclinB1復(fù)合物控制.G2到M期的進(jìn)程是由激活的cdc2/cyclinB1復(fù)合物所驅(qū)動(dòng)的.cdc2/cyclinB1異型二聚體被激活后，有絲分裂被啟動(dòng)，其活性從有絲分裂的前期必須維持到中期之前.進(jìn)入后期，cdc2/cyclinB1的活性由于cyclinB1的降解而崩解.分裂期開始時(shí)，cdc25c使cdc2的賴氨酸15位點(diǎn)(Tyr15)和蘇氨酸14位點(diǎn)(Thr14)去磷酸化，從而活化cdc2/cyclinB1復(fù)合物活力，細(xì)胞開始分裂.當(dāng)cdc25c的絲氨酸216位點(diǎn)(Ser216)被磷酸化后，14－3－3蛋白將cdc25c束縛在胞漿中，從而干擾cdc25c對(duì)cdc2的去磷酸化，進(jìn)而使cdc2/cyclinB1復(fù)合物活力降低.

研究表明有絲分裂災(zāi)難與M期cdc2/cyclinB1復(fù)合物活力下降有關(guān).在土槿皮乙酸誘導(dǎo)小鼠成纖維L929細(xì)胞周期阻滯的研究中發(fā)現(xiàn)，土槿皮乙酸作用細(xì)胞0－24h cdc2蛋白水平無(wú)明顯變化，而cyclinB1蛋白水平與時(shí)間成正比上升;24 h后cdc2蛋白水平有所下降，而cyclinB1急劇下降.cyclinB1的降解導(dǎo)致cdc2/cyclinB1復(fù)合物活力降低使L929細(xì)胞阻滯于M期，最終發(fā)生有絲分裂災(zāi)難[6].在白屈菜堿誘導(dǎo)人胃癌SGC－7901細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物作用48 h后cdc2和 cyclinB1 蛋白水平均下降[7－8].

2.2 Plk 激酶

在Plk(Polo－like kinase)激酶家族中，Plk1在細(xì)胞分裂中具有最廣泛的功能，它在有絲分裂過(guò)程中對(duì)染色體的分離、中心體的復(fù)制、紡錘體的形成、胞質(zhì)的分裂都有重要的作用，是染色體DNA復(fù)制必不可少的激酶類[9].應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAi)抑制人胃癌MKN－45細(xì)胞Plk1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Plk1mRNA及蛋白質(zhì)水平在一定時(shí)間內(nèi)均明顯降低，更多的MKN－45細(xì)胞阻滯于G2/M期，細(xì)胞無(wú)法從G2期過(guò)渡到M期，或進(jìn)入了M期卻不能完成分裂[10].在食管癌細(xì)胞的研究中，使用RNA沉默技術(shù)抑制Plk1的表達(dá)，可導(dǎo)致姐妹染色單體分離不徹底和胞質(zhì)分裂失敗，使細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難[11].目前研究結(jié)果提示Plk1可能將會(huì)是今后具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物或基因抗癌靶點(diǎn).

3 有絲分裂災(zāi)難與紡錘體組裝檢查點(diǎn)

紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)工作始于細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期直到所有染色體都正確排列，它監(jiān)控著微管的結(jié)構(gòu)、染色體附著情況，并在有絲分裂紡錘體裝置正確配置前延遲姐妹染色單體分離.著絲點(diǎn)相關(guān)蛋白Mad2，BubR1，Bub1和Bub3是紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)通路的關(guān)鍵組分.這些蛋白可以附著于沒(méi)有結(jié)合微管的著絲點(diǎn)上，從而在紡錘體功能失調(diào)時(shí)阻止有絲分裂進(jìn)入后期.細(xì)胞進(jìn)入M期后，能否跳出M期完全由SAC控制.任何干擾姐妹染色體與紡錘體正確結(jié)合的因素都會(huì)激活SAC.正常情況下，進(jìn)入M中期的細(xì)胞會(huì)迅速激活后期促進(jìn)因子(anaphas－promoting complex，APC)，破壞姐妹染色單體的粘連，使相關(guān)cdks復(fù)合物失活，從而完成有絲分裂和胞質(zhì)分裂.由于SAC對(duì)微管蛋白動(dòng)力作用、中心體分離異常、中心體和動(dòng)粒結(jié)構(gòu)的變化及嚴(yán)重的DNA損傷敏感，所以各種因素都直接或間接的激發(fā)SAC信號(hào)，APC失活，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于M中后期的交界處[12].然而，有絲分裂災(zāi)難之所以發(fā)生，形成多核細(xì)胞，是由于細(xì)胞發(fā)生了有絲分裂滑脫.有絲分裂滑脫是指細(xì)胞發(fā)生了SAC適應(yīng)，在沒(méi)有徹底修復(fù)已損傷的紡錘體的情況下，能夠越過(guò)，突破該檢查點(diǎn)，跳出直接至下一個(gè)細(xì)胞周期的G1期，形成4倍體或多倍體的假G1細(xì)胞.這種細(xì)胞失去了分裂能力，維持在G1期，具有多個(gè)微核，可以存活數(shù)天但不具細(xì)胞活性，數(shù)天后通過(guò)衰老或凋亡死亡.這種現(xiàn)象的產(chǎn)生和cyclinB1降解、cdc2/cyclinB1失活，cdk抑制分子的作用密切相關(guān)[6].有絲分裂災(zāi)難細(xì)胞有多種命運(yùn)，例如死于分裂期，進(jìn)入下一個(gè)周期的G1期后再死亡和有絲分裂滑脫跳出分裂期進(jìn)入衰老狀態(tài)[3].最新研究發(fā)現(xiàn)一種從雞貧血病毒(CAV)中獲得的病毒蛋白凋亡素可選擇性地誘導(dǎo)人類腫瘤細(xì)胞死亡.它在在骨肉瘤細(xì)胞中通過(guò)非p53途徑使紡錘體形成異常，并使有絲分裂期的非雙極主軸細(xì)胞增加了10倍，使有絲分裂周期加長(zhǎng)出現(xiàn)異常核分裂，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難死亡[13].另有研究發(fā)現(xiàn)212Pb放射免疫療法也是通過(guò)干擾有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)從而加強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難死亡[14].

BubR1是酵母細(xì)胞有絲分裂檢查點(diǎn)基因家族中的一員，其編碼的蛋白是紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的重要組成成分之一.BubR1通過(guò)參與監(jiān)測(cè)有絲分裂過(guò)程中微管與著絲點(diǎn)間的結(jié)合狀態(tài)，感受著絲點(diǎn)上張力的情況來(lái)確保染色體的正確分離以及細(xì)胞有絲分裂過(guò)程.BubR1的表達(dá)水平與紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的功能存在一定的劑量依賴效應(yīng)，該基因一旦缺失將引起大量非整倍體的產(chǎn)生，從而引發(fā)紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的妥協(xié)反應(yīng).近來(lái)有關(guān)BubR1的功能和作用機(jī)制等方面引起了越來(lái)越多研究人員的關(guān)注[15].BPR0L075[6－ 甲氧基 －3 － (3＇，4＇，5＇－ 三甲氧基苯甲?；?－1H－吲哚]是一種新合成的微管抑制劑，具有高效和廣譜的細(xì)胞毒作用，對(duì)卵巢癌細(xì)胞及耐紫杉醇藥的卵巢癌細(xì)胞均有較好的效果[11].其作用機(jī)制一方面是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一方面是上調(diào)耐紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞cyclinB1，BubR1以及MPM－2和Survivin蛋白水平，使Bcl－XL磷酸化進(jìn)而發(fā)生G2/M期阻滯，形成多核巨細(xì)胞，發(fā)生有絲分裂災(zāi)難.從民間抗腫瘤草藥旱生香茶菜(Isodon xerophilus)中分離得到的化合物Pharicin A是貝殼杉烯二萜類化合物.研究發(fā)現(xiàn)Pharicin A能夠誘導(dǎo)白血病和實(shí)體腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難.其作用機(jī)制與染色體排布異常、BubR1定位異常和解除紡錘體檢查點(diǎn)的檢測(cè)有關(guān).此外，Pharicin A也可誘導(dǎo)紫杉醇耐藥的人類白血病細(xì)胞Jurkat和人骨肉瘤細(xì)胞U－2OS發(fā)生有絲分裂災(zāi)難[16].

4 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難的相關(guān)藥物

紫杉醇在卵巢癌和乳腺癌的治療中起主要作用，主要通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定.半合成紫杉類抗腫瘤藥物多西紫杉醇用于治療乳腺癌和前列腺癌，抗腫瘤活性比紫杉醇高[17].其作用機(jī)制也可通過(guò)干擾細(xì)胞有絲分裂和分裂間期細(xì)胞功能所必需的微管網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難死亡而起到抗腫瘤作用.帕唑帕尼能有效的抑制細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)激酶，紫杉醇與其結(jié)合可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，其增效與有絲分裂災(zāi)難有關(guān)[18].Zuryń A 等[19]用不同濃度的阿霉素(0.05，0.1 和 0.15 μmol/L)作用于人類白血病細(xì)胞Jurkat，發(fā)現(xiàn)低劑量治療后，Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，cyclinB1，cyclinA和cyclinD1蛋白表達(dá)量升高，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和有絲分裂災(zāi)難.腎茶(Clerodendranthus spicatus)中的有效成分澤蘭黃素可以非特異性抑制許多蛋白激酶，使細(xì)胞有絲分裂不能正常進(jìn)行，發(fā)生細(xì)胞G2/M期阻滯，誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)難[20].

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