二苯乙烯苷對大鼠成骨細胞增殖及分化的影響

武繼偉

何首烏為蓼科多年生草本植物的塊根。一直以來被認為具有益壽延年、延緩衰老之功效，系著名的滋補中藥［1］。研究表明，何首烏中的主要水溶性成分為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG，二苯乙烯苷)［2］。2000年藥典將測定THSG化合物的含量作為何首烏及其制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。典靈輝等［3］發(fā)現(xiàn)何首烏的乙酸乙酯提取物能促進大鼠顱骨成骨細胞的增殖，并根據(jù)粗提物含量測定結(jié)果推測發(fā)揮這種作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是THSG。本研究旨在從細胞水平證實THSG對成骨細胞增殖、分化的影響并初步探明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 THSG由本實驗室提取，經(jīng)

HPLC檢測純度＞98%;DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、青霉素G、硫酸慶大霉素(Ameresco公司);MTT試劑、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒(南京生物建成公司出品);Elisa試劑(Invitrogen公司);其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離、培養(yǎng)與傳代:大鼠成骨細胞按照文獻所述的方法進行分離、培養(yǎng)和傳代［4］，實驗采用第3～4代細胞。將大鼠成骨細胞以5×104個/皿的密度接種于6孔板中，或以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)板中的細胞隨機分組，進行相應(yīng)的干預(yù)處理。

1.2.2 實驗分組與處理

1.2.2.1 細胞增殖測定:采用 MTT試劑盒檢測細胞增殖活性。待細胞70%～80%融合時，除陰性對照組外，其余各組加入加入不同濃度的 THSG(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和10 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 ml MTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，振蕩10 min，使甲臢充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長測定光密度OD值。OD值大小與活細胞數(shù)成正比，細胞存活率以對照組為100%，給藥組的細胞存活率=給藥組的光吸收值(OD)/對照組光吸收值(OD)×100%。

1.2.2.2 細胞ALP活性比測定:于不同濃度二苯乙烯苷干預(yù)后第3天檢測ALP活性比，采用PBS液漂洗皿中細胞 3 次，每皿中加入 0.1%TritonX 100 500 μl，置于4℃冰箱內(nèi)12 h，期間將培養(yǎng)皿中裂解液置于－30℃冰箱中反復(fù)凍融3次。依據(jù)試劑盒說明書流程，檢測單位體積裂解液中的ALP活性，同時使用BCA試劑盒檢測細胞裂解液中的總蛋白濃度做內(nèi)參調(diào)平，計算每克樣本中ALP的活性。

1.2.2.3 Elisa方法檢測:應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中c-fos和c-jun水平。在包被單抗的微孔中依次加入c-fos/c-jun抗原、生物素化的抗大鼠c-fos/c-jun抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的c-fos/c-jun呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。給藥組c-fos/c-jun的表達水平=給藥組的光吸收值(OD)/對照組光吸收值(OD)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，進行one-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THSG對細胞增殖活性影響 MTT檢測結(jié)果顯示:與對照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內(nèi)，隨著THSG濃度的升高，成骨細胞增殖活性明顯增高(P＜0.05 或 ＜0.01)。見圖1。

圖1 THSG對大鼠成骨細胞增殖活性的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.2 THSG對細胞ALP表達影響 2組成骨細胞ALP活性比檢測結(jié)果顯示:與對照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內(nèi)，隨著THSG濃度的升高，成骨細胞ALP表達顯著上升(P＜0.05或 ＜0.01)。見圖2。

圖2 THSG對大鼠成骨細胞ALP表達的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.3 THSG對c-fos和c-jun蛋白表達的影響 經(jīng)以上處理第3天時，2組細胞c-fos和c-jun表達較對照組明顯增高(P＜0.05或 ＜0.01)。見表1。

表1 THSG對大鼠成骨細胞c-fos和c-jun表達的影響±s

表1 THSG對大鼠成骨細胞c-fos和c-jun表達的影響±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

c-fos 1.00 ±0.15 1.08 ±0.07* 1.20 ±0.15# 1.35 ±0.09#c-jun 1.00 ±0.25 1.10 ±0.03* 1.30 ±0.12# 1.40 ±0.60#

3 討論

多年來，何首烏的研究大多停留在對何首烏粉、制首烏或何首烏粗提物的功效性探究。采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，深入研究其主要成分的藥理作用對中藥走向現(xiàn)代化走向世界具有重要意義。

本實驗采用MTT比色法檢測主要水溶性成分THSG對細胞增殖的影響，具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點。實驗證明，何首烏的THSG在0.03～10 mg/ml的寬廣范圍內(nèi)有明確的促進成骨細胞增殖的作用，表現(xiàn)出高效、低毒的特點。

堿性磷酸酶ALP是成骨細胞分化的主要特征性酶之一，可以水解有基磷酸酯，提高局部無機磷離子的濃度，促進鈣化的發(fā)生。對ALP活性的檢測是鑒定成骨細胞和評價其功能活性的重要指標(biāo)之一。本研究顯示，保持較高的ALP活性是THSG體外促進大鼠成骨細胞分化成熟的典型特征之一。

C-fos和c-jun是與細胞增殖相關(guān)的原癌基因，是調(diào)控細胞分化和發(fā)育的即刻早期基因，亦稱快速反應(yīng)基因，因在外界因素刺激后迅速表達而得名［5］。C-fos和c-jun在正常情況下大多數(shù)細胞內(nèi)均有低水平的表達。在外來因素刺激下，c-fos和c-jun經(jīng)過廣泛的修飾加工后跨核膜進入細胞核內(nèi)，二者通過亮氨酸拉鏈形式1∶1構(gòu)成異源二聚體或同源二聚體，與靶基因上調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)結(jié)合位點相結(jié)合后影響靶基因表達，與細胞增殖密切相關(guān)。本研究中，THSG顯著誘導(dǎo)c-fos和c-jun，可能是其促進增殖和破骨細胞的分化、成熟的機制之一。

1 呂麗爽.何首烏中二苯乙烯苷的研究進展.食品科學(xué)，2006，27:608-615.

2 張純，楊少麟.高效液相色譜法測定何首烏中二苯乙烯甙的含量及其穩(wěn)定性考察.中國中藥雜志，1999，24:357-360.

3 典靈輝，程紀(jì)倫，陸江贏，等.德慶何首烏提取物對成骨細胞增殖的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40:8885-8886.

4 韓娜，王天兵，寇玉輝，等.人工虎骨粉干預(yù)大鼠成骨細胞增殖和Ⅰ型膠原的表達.中國組織工程研究，2012，16:201-205.

5 武密山，趙素芝，任立中，等.柚皮苷對乳鼠成骨細胞增殖及c-fos、cjun表達的影響.中國藥理學(xué)通報，2011，27:677-681.