脫精氨酸補體C3f對刀豆蛋白A誘導的急性免疫性肝損傷的保護作用

員美娜，劉志鵬，王 佳，劉斯靜，池 冰，劉殿武*(.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院社會醫(yī)學與衛(wèi)生事業(yè)管理學教研室，河北 石家莊 05007；.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，河北 石家莊 05007；3.內蒙古自治區(qū)呼和浩特市食品化妝品監(jiān)督管理所學校食堂食品衛(wèi)生安全監(jiān)管科，內蒙古 呼和浩特 0000；.河北醫(yī)科大學期刊社，河北 石家莊 05007)

·研究快報·

脫精氨酸補體C3f對刀豆蛋白A誘導的急性免疫性肝損傷的保護作用

員美娜1，劉志鵬2,3，王 佳2，劉斯靜4，池 冰2，劉殿武2*
(1.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院社會醫(yī)學與衛(wèi)生事業(yè)管理學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，河北 石家莊 050017；3.內蒙古自治區(qū)呼和浩特市食品化妝品監(jiān)督管理所學校食堂食品衛(wèi)生安全監(jiān)管科，內蒙古 呼和浩特 010010；4.河北醫(yī)科大學期刊社，河北 石家莊 050017)

肝炎，自身免疫性；脫精氨酸補體C3f；刀豆蛋白A

肝臟疾病是一個巨大的全球性公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著數(shù)十億人的健康[1-2]。病毒感染、自身免疫狀態(tài)、攝入酒精及一些特定藥物，均可以導致肝炎的發(fā)生，而且易進展為肝硬化、肝衰竭或肝癌。目前有許多治療方法可以促進肝功能的恢復，但是仍有很大比例的肝炎患者對于治療無有效應答[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脫精氨酸補體C3f(complement C3f des-arginine,DRC3f)在輕中重度慢性乙型肝炎患者血清中表達差異有統(tǒng)計學意義[4]。提示DRC3f可能參與了肝炎病情進展的某種機制。本研究通過建立刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導的肝損傷模型，探討外源性給予DRC3f對急性免疫性肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：Balb/c近交系6～8周齡雄性小鼠124只，體質量18～22g，購于河北省實驗動物中心。

1.2 實驗分組與處理

1.2.1 預防性給藥實驗：將32只小鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、陽性對照組和DRC3f預防性給藥組，每組8只。正常組小鼠給予2次0.25mL生理鹽水。模型組、陽性對照組和DRC3f預防性給藥組小鼠分別經(jīng)尾靜脈給予0.25mL生理鹽水，500μg/kg地塞米松和800μg/kg DRC3f(上海生工生物工程技術有限公司)，1h后經(jīng)尾靜脈注射12mg/kg Con A(美國Sigma公司)。注射Con A 12h后處死小鼠，采集血清，應用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransaminase,ALT)和天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平。分離肝組織，石蠟包埋切片后進行HE染色。

1.2.2 治療性給藥實驗：分組及正常組處理與預防性給藥實驗相同。模型組、陽性對照組和DRC3f治療性給藥組小鼠先經(jīng)尾靜脈注射12mg/kg Con A，0.5h后給予相應藥物治療。12h后處死小鼠，后續(xù)處理同上。

1.2.3 生存分析實驗：另取60只小鼠隨機分為2個大組，即預防性給藥組和治療性給藥組。然后再將每個大組隨機分為3個亞組，即模型組、陽性對照組和DRC3f組，每組10只。各組均于注射致死劑量25mg/kg Con A 1h前(預防性給藥組)或0.5h后(治療性給藥組)分別給予對應藥物處理，觀察72h內小鼠的生存情況，每小時記錄1次。

2 結 果

2.1 DRC3f預防性給藥對Con A誘導肝損傷的影響：模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于正常組(P<0.01)；陽性對照組和DRC3f預防性給藥組血清ALT和AST水平較模型組均明顯降低(P<0.01)，但未達到正常組水平(P<0.01)，且陽性對照組與DRC3f預防性給藥組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。組織病理學結果可見，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量肝細胞壞死，陽性對照組和DRC3f預防性給藥組未見明顯壞死。

2.2 DRC3f治療性給藥對Con A誘導肝損傷的影響：模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著高于正常組(P<0.01)；DRC3f治療性給藥組小鼠血清ALT和AST水平均顯著低于模型組(P<0.01)，陽性對照組小鼠血清ALT和AST水平也均低于模型組(P<0.01)，其中ALT水平略高于DRC3f治療性給藥組(P=0.044)，AST水平與DRC3f治療性給藥組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.080)，但均未降至正常組水平。組織病理學結果顯示，模型組小鼠肝組織有大量肝細胞壞死，陽性對照組和DRC3f治療性給藥組肝細胞壞死情況均較模型組有所改善。

2.3 DRC3f給藥對注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響：在預防性給藥生存率實驗中，模型組小鼠給予25mg/kg Con A后72h生存率為20% (2/10)，中位生存時間為11h；陽性對照組小鼠72h生存率為80% (8/10)，中位生存時間為72h，生存情況較模型組有明顯改善(P=0.004)；DRC3f給藥組小鼠72h生存率為70% (7/10)，中位生存時間為72h，生存情況較模型組也得到顯著改善(P=0.01)。在治療性給藥生存率實驗中，模型組小鼠72h生存率為20% (2/10)，中位生存時間為13h；陽性對照組小鼠72h生存率為60% (6/10)，中位生存時間為72h，生存情況較模型組有明顯改善(P=0.011)；DRC3f給藥組小鼠72h生存率為40% (4/10)，中位生存時間為37h，生存情況相比模型組也有顯著改善(P=0.029)。地塞米松和DRC3f預防性給藥實驗組小鼠生存率和中位生存時間雖好于治療性給藥實驗組，但二者之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

本課題組前期在尋找肝炎早期生物標志物的研究中采用飛行時間質譜發(fā)現(xiàn)，DRC3f在輕中度乙型肝炎患者血清中含量較高，而在重度肝炎患者血清中含量較低，表達差異明顯，提示該多肽可能參與了乙型肝炎感染及其病情進展的某種機制[4]。此外，使用合成的DRC3f體外刺激正常人肝細胞QSG-7701，發(fā)現(xiàn)DRC3f對肝細胞增殖有促進作用[4]。

Con A是一種植物凝集素，可以引起肝細胞壞死，導致血清ALT和AST水平升高。DRC3f預防性給藥組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，模型組出現(xiàn)大面積肝細胞壞死，而DRC3f預防性給藥組小鼠肝細胞未見明顯壞死，可見DRC3f對于Con A誘導的急性免疫性肝損傷有保護性作用。DRC3f治療性給藥雖然也能降低ALT和AST，但組織病理學結果顯示有肝細胞壞死。Con A誘導的肝損傷具有劑量依賴性，肝臟損害隨藥物劑量加大而加重。為進一步驗證DRC3f的作用，我們檢測了注射致死劑量Con A后小鼠72h內的生存情況。DRC3f顯著提高了小鼠的生存率，并且延長了生存時間，表明DRC3f可以改善小鼠的生存情況。

地塞米松是糖皮質激素類藥物，具有抗炎、抗過敏、抗休克和免疫抑制作用，可用于治療自身免疫性肝炎、重度肝炎等疾病。本研究采用地塞米松作為對Con A誘導肝損傷發(fā)揮保護作用的陽性對照組。結果表明，地塞米松可以顯著改善Con A誘導的肝損傷，降低血清ALT和AST水平，減少肝細胞壞死，改善給予致死劑量Con A小鼠的生存情況，效果與DRC3f接近。但是它在較大劑量給藥時容易引起消化道潰瘍或類腎上腺皮質功能亢進綜合征，還可能引起并發(fā)感染等不良反應，因此其在臨床上的應用受到一定限制。

體外合成DRC3f方法較簡單，容易獲得，對人體侵入性小，對急性免疫性肝炎預防和治療效果較好，但是其應用的安全性和作用機制尚不十分明確，有待于進一步的研究。

[1] GUAN YS,HE Q.A Current update on the rule of alternative and complementary medicine in the treatment of liver diseases[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:321234.

[2] 曹慧穎,邵鵬,石金升.骨髓間充質干細胞治療肝纖維化研究進展[J].河北醫(yī)科大學學報,2012,33 (2):240-242.

[3] YAN S,WANG L,LIU N,et al.Critical role of interleukin-17/ interleukin-17 receptor axis in mediating Con A-induced hepatitis[J].Immunol Cell Biol,2012,90(4):421-428.

[4] 李曼,王劍，戴二黑，等.慢性乙型肝炎血清差異性多肽DRC3f 的鑒定及作用研究[J].衛(wèi)生研究,2011,40 (3):315-319.

(本文編輯：趙麗潔)

2014-10-15；

2014-11-18

河北省科技計劃項目(13277732D)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究重點課題(20110041)

員美娜(1988-)，女，滿族，河北唐山人，河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院助教，醫(yī)學碩士，從事肝病分子流行病學研究。

*通訊作者。E-mail:liudw56@tom.com

R575.1

B

1007-3205(2014)12-1460-02

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.036