微藻培養(yǎng)基平衡pH的研究

張 丹朱曉艷溫小斌耿亞紅李夜光

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢植物園, 中國(guó)科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430074; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微藻培養(yǎng)基平衡pH的研究

張 丹1,2朱曉艷1,2溫小斌1,2耿亞紅1李夜光1

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢植物園, 中國(guó)科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430074; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

“平衡pH”是“培養(yǎng)基中二氧化碳分壓與空氣中二氧化碳分壓平衡時(shí)的pH”, 是微藻培養(yǎng)基的一個(gè)重要特征參數(shù)。選用常用的三種微藻培養(yǎng)基: BG11培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)基和Zarrouk培養(yǎng)基, 使用鼓泡通入空氣的方法, 研究碳源、氮源、磷源濃度和鹽度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH的影響。結(jié)果如下: 在NaHCO3濃度0—16.8 g/L范圍內(nèi), 三種培養(yǎng)基的平衡pH都隨碳源濃度的增加而升高; NaNO3濃度在0—2.5 g/L范圍內(nèi), 對(duì)培養(yǎng)基平衡pH沒(méi)有影響; 0.1 g/L KH2PO4使BG11培養(yǎng)基的平衡pH稍有升高, 與之相反, BBM培養(yǎng)基的平衡pH稍有下降, 進(jìn)一步提高磷(P)濃度(最高 0.4 g/L), BG11培養(yǎng)基和 BBM培養(yǎng)基的平衡 pH不再變化; P濃度變化對(duì)Zarrouk培養(yǎng)基的平衡pH沒(méi)有影響; 三種培養(yǎng)基的平衡pH都隨鹽度的升高而降低。碳源濃度是影響培養(yǎng)基平衡 pH的最主要因素, 平衡 pH與碳源濃度的關(guān)系可以用回歸方程 y=0.3504ln(x)+8.9647(R2=0.9708)表示,氮源濃度對(duì)平衡pH沒(méi)有顯著影響, 磷源濃度和鹽度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH有影響, 但影響不大?？刂圃逡簆H不低于平衡pH, 可以提高微藻培養(yǎng)中CO2的利用效率, 有利于實(shí)現(xiàn)微藻CO2生物固定的環(huán)境效益。

微藻; 平衡pH; 培養(yǎng)基; 碳濃度

世界上商業(yè)化生產(chǎn)的微藻(Micro algae)主要有螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、紅球藻(Haematococcus)和杜氏藻(Dunaliella)等[1—4], 已經(jīng)被開發(fā)為保健品和珍貴水產(chǎn)品的飼料添加劑。某些微藻細(xì)胞中可以積累大量油脂, 其中的三酰甘油酯(TAG)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯化生成脂肪酸甲酯, 就是生物柴油,可以替代化石燃料[5,6], 利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有多種優(yōu)勢(shì)[7,8]。微藻有望成為繼糧食作物生物乙醇、纖維素生物乙醇和陸生作物生物柴油之后第三代生物質(zhì)能源的原材料[9]。

目前, 規(guī)模化培養(yǎng)微藻都是采用液體培養(yǎng), 如何高效地向藻液中補(bǔ)充 CO2, 一直是研究者們關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題[10]。研究者們注意到, 在一定的條件下, 藻液中的CO2會(huì)向空氣中釋放, 造成碳源的浪費(fèi)[11,12]。李夜光等[13,14]研究發(fā)現(xiàn)藻液的 pH決定螺旋藻培養(yǎng)液向空氣中釋放 CO2, 還是從空氣中吸收 CO2, 當(dāng)藻液的 pH高于“培養(yǎng)液的 CO2濃度與空氣中 CO2濃度相平衡時(shí)的 pH”, 藻液從空氣中吸收 CO2, 反之, 藻液向空氣中釋放 CO2。我們?cè)谂囵B(yǎng)微藻的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)“培養(yǎng)液的 CO2濃度與空氣中 CO2濃度相平衡時(shí)的 pH”是微藻培養(yǎng)基的一個(gè)重要特征參數(shù),將其稱為“空氣平衡 pH”, 簡(jiǎn)稱“平衡 pH”, 并給“平衡pH”一個(gè)規(guī)范的定義: “培養(yǎng)基中二氧化碳分壓與空氣中二氧化碳分壓平衡時(shí)的 pH”。與螺旋藻培養(yǎng)基一樣, 當(dāng)各種微藻培養(yǎng)基 pH低于其“平衡 pH”,藻液向空氣中釋放 CO2, 隨著 CO2的釋放, 培養(yǎng)基pH升高, 直到達(dá)到平衡pH, 培養(yǎng)基不再向空氣中釋放CO2; 當(dāng)培養(yǎng)基的pH高于平衡pH, 培養(yǎng)基從空氣中吸收CO2, 隨著CO2的吸收, 培養(yǎng)基pH下降, 直到達(dá)到平衡 pH, 培養(yǎng)基不再?gòu)目諝庵形?CO2, 此時(shí), CO2的吸收和釋放達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。利用煙道氣中的 CO2為碳源培養(yǎng)產(chǎn)油微藻是目前微藻生物柴油研發(fā)的一個(gè)重要指導(dǎo)思想。對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng), 如何高效地利用CO2, 盡量減少培養(yǎng)過(guò)程中CO2向空氣的釋放,是必須解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。目前, 未見對(duì)微藻培養(yǎng)基平衡pH深入研究的報(bào)道。

本文選擇有代表性的三種培養(yǎng)基, BG11培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)和Zarrouk培養(yǎng)基, 研究培養(yǎng)基的主

1 材料與方法

改良的BG11培養(yǎng)基[15]; BBM培養(yǎng)基; 改良的Zarrouk培養(yǎng)基(除NaHCO3濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變化外, 培養(yǎng)基其他成分及濃度與Zarrouk培養(yǎng)基相同)。

1.2 碳源、氮源、磷源及鹽度濃度設(shè)置

碳源、氮源、磷源及鹽度實(shí)驗(yàn)使用的藥品及其濃度見表1。

表1 培養(yǎng)基 C、N、P濃度及鹽度Tab. 1 Salinity and the concentration of C, N and P of the medium

根據(jù)表1中的濃度配制BG11、BBM、Zarrouk培養(yǎng)基。BG11培養(yǎng)基的磷源為K2HPO4·3H2O, BBM培養(yǎng)基的磷源為K2HPO4·3H2O和KH2PO4, Zarrouk培養(yǎng)基的磷源為KH2PO4。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置及實(shí)驗(yàn)條件

1.4 培養(yǎng)基pH的測(cè)定

采用 MODEL 868 pH 計(jì)(Thermo Electron Corporation)測(cè)定培養(yǎng)基的pH。

1.5 培養(yǎng)基平衡pH的測(cè)定

取200 mL培養(yǎng)基于通氣培養(yǎng)裝置的玻璃培養(yǎng)管中(每種處理設(shè)3個(gè)平行樣), 在液面處做標(biāo)記。向培養(yǎng)基中通入空氣, 每隔一段時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)基的 pH,測(cè)pH之前向玻璃培養(yǎng)管中加入蒸餾水使液面回到初始位置, 補(bǔ)充蒸發(fā)的水分。待培養(yǎng)基的pH沒(méi)有顯著變化時(shí)停止通氣, 此時(shí)的pH即為培養(yǎng)基的平衡pH。

2 結(jié)果

2.1 碳源濃度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH的影響

向不同碳源濃度的培養(yǎng)基鼓泡通入空氣, BG11、BBM和Zarrouk培養(yǎng)基的pH表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì), 這種變化又分為兩種模式: (1)沒(méi)加碳源的培養(yǎng)基pH基本沒(méi)有變化, 維持初始的pH; (2)補(bǔ)加碳源的培養(yǎng)基的 pH在通氣后的 5h內(nèi)快速升高, 5—10h, pH上升明顯減緩, 10h后, pH雖然隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 但是變化已經(jīng)非常緩慢, 30h后, pH達(dá)到穩(wěn)定(圖1)。

培養(yǎng)基的pH保持穩(wěn)定, 說(shuō)明培養(yǎng)基向空氣中釋放 CO2的速率與從空氣中吸收 CO2的速率相同, 表示培養(yǎng)基中CO2的分壓等于空氣中CO2的分壓[14,16],根據(jù)平衡pH的定義, 對(duì)應(yīng)的pH就是培養(yǎng)基的平衡pH。不同碳源濃度培養(yǎng)基的平衡pH見表2。

2.2 氮源濃度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH的影響

不同氮源濃度的 BG11和BBM培養(yǎng)基的初始pH分別在7.8和6.7上下, 通氣后, BG11和BBM培養(yǎng)基的 pH稍有下降, 很快分別穩(wěn)定在 7.3和 6.6上下(圖未顯示);不同氮源濃度的Zarrouk培養(yǎng)基的初始pH在7.8上下, 在通氣后, 30h后達(dá)到穩(wěn)定(圖未顯示)。不同氮源濃度的BG11、BBM和Zarrouk培養(yǎng)基的平衡pH如表3所示。

圖1 不同碳源濃度的培養(yǎng)基pH隨通氣時(shí)間的變化Fig. 1 pH value-time course of medium with different concentration of carbon during bubbling aeration

2.3 磷源濃度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH的影響

不同磷源濃度的BG11和BBM培養(yǎng)基的初始pH分別為6.9—7.8和6.18—8.57, 在通氣后, BG11和BBM培養(yǎng)基的pH稍有下降, 逐步達(dá)到穩(wěn)定; 不同磷源濃度的 Zarrouk培養(yǎng)基的初始 pH 在7.71—8.19范圍內(nèi), 在通氣后, pH逐步上升, 30h后達(dá)到穩(wěn)定(圖未顯示)。不同磷源濃度的BG11、BBM和Zarrouk培養(yǎng)基的平衡pH如表4所示。

表2 不同碳源濃度培養(yǎng)基的平衡pH(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差) Tab. 2 Equilibrium pH values (means±SD) of medium with different concentration of NaHCO3

表3 不同氮源濃度培養(yǎng)基的平衡pH(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 3 Equilibrium pH values (means±SD) of medium with different concentration of NaNO3

表4 不同磷源濃度培養(yǎng)基的平衡pH(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 4 Equilibrium pH values (means±SD) of medium with different P concentration

2.4 鹽度對(duì)培養(yǎng)基平衡pH的影響

不同鹽度的BG11和BBM培養(yǎng)基的初始pH分別為7.3—7.5和5.9—6.3, 通氣后, BG11和BBM培養(yǎng)基的pH稍有下降, 10h后達(dá)到穩(wěn)定; 不同鹽度的Zarrouk培養(yǎng)基的初始 pH7.6—7.8, 在通氣后, pH逐步上升, 35h后達(dá)到穩(wěn)定(圖未顯示)。不同鹽度的BG11、BBM和 Zarrouk培養(yǎng)基的平衡 pH如表 5所示。

表5 不同鹽度培養(yǎng)基的平衡pH(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 5 Equilibrium pH values (means±SD) of medium with different salinities

3 討論

3.1 碳源濃度對(duì)平衡pH的影響

培養(yǎng)基“平衡pH”的定義是: 培養(yǎng)基中二氧化碳分壓與空氣中二氧化碳分壓相等時(shí)的 pH?？諝庵蠧O2相對(duì)穩(wěn)定, 培養(yǎng)基中二氧化碳分壓主要取決于碳源的濃度, 可見, 碳源濃度是影響微藻培養(yǎng)基平衡pH的主要因素。

表 2數(shù)據(jù)顯示, 當(dāng)培養(yǎng)基其他成分不變, 隨著碳源濃度的增加, 平衡pH先快速升高, 碳源濃度對(duì)培養(yǎng)基的平衡 pH的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01);然后升高幅度趨于緩慢, 當(dāng)碳源濃度達(dá)到4.2 g/L時(shí),平衡 pH幾乎不再隨著碳源濃度的增加而升高, 碳源濃度的影響不顯著(P>0.05)。出現(xiàn)這種情況很可能與 CO2的活度有關(guān), 當(dāng)碳源濃度較高時(shí), 隨著碳源的進(jìn)一步增加, 雖然 CO2的濃度增加, 但是其活度并未顯著增加, CO2分壓相應(yīng)也沒(méi)有顯著增加, 平衡pH基本不變。

除了不加碳源使Zarrouk培養(yǎng)基的平衡pH明顯低于BG11和BBM培養(yǎng)基, 其他碳源濃度下, 三種培養(yǎng)基的平衡pH很接近。以BG11培養(yǎng)基為例, 將平衡pH對(duì)碳源濃度做圖(圖2), 培養(yǎng)基平衡pH與碳源濃度的關(guān)系可以用回歸方程 y=0.3504ln(x)+8.9647 (R2=0.9708)表示。

圖2 平衡pH隨碳源濃度的變化Fig. 2 Equilibrium pH values changing with NaHCO3concentrations

3.2 氮源濃度對(duì)平衡pH的影響

BBM培養(yǎng)基不含碳源, BG11培養(yǎng)基含有低濃度碳源(0.02 g/L Na2CO3), Zarrouk培養(yǎng)基含有高濃度碳源(6 g/L NaHCO3), 三種培養(yǎng)基的平衡pH都不隨氮源濃度的改變而變化(P>0.05)(表 3), 表明無(wú)論培養(yǎng)基 CO2分壓高或低, 都不受氮源(NaNO3)濃度變化的影響。氮源濃度對(duì)平衡pH沒(méi)有影響, 我們認(rèn)為有兩方面原因: (1)NaNO3是中性化合物, 不能與三種碳源形式發(fā)生任何的化學(xué)反應(yīng)從而影響化學(xué)反應(yīng)方程式(1)和(2)的平衡移動(dòng); (2)在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi), NaNO3濃度的變化沒(méi)有對(duì)CO2的活度產(chǎn)生顯著的影響。

3.3 磷源濃度對(duì)平衡pH的影響

磷源(K2HPO4·3H2O、KH2PO4)濃度對(duì) BG11和BBM培養(yǎng)基的平衡pH有一定作用, 但是影響不大。0.1 g/L磷源小幅度提高了BG11培養(yǎng)基的平衡pH,但是卻小幅度降低了BBM培養(yǎng)基的平衡pH, 磷源濃度的進(jìn)一步升高, 兩種培養(yǎng)基的平衡 pH基本不再變化(表4)。為什么磷源提高BG11的平衡pH, 卻降低了BBM的平衡pH？可能與兩種培養(yǎng)基的化學(xué)成分不同有關(guān): BG11培養(yǎng)基含有少量Na2CO3(0.02 g/L), BBM 培養(yǎng)基不含碳源; BG11培養(yǎng)基的磷源是K2HPO4·3H2O, BBM培養(yǎng)基的磷源是K2HPO4·3H2O+ KH2PO4。

磷源濃度對(duì)Zarrouk培養(yǎng)基的平衡pH沒(méi)有顯著影響(P>0.05), 是因?yàn)?Zarrouk培養(yǎng)基中的 NaHCO3濃度高(6 g/L), NaHCO3是決定培養(yǎng)基平衡pH的因素, 磷源對(duì)平衡pH的影響不能表現(xiàn)出來(lái)。

3.4 鹽度對(duì)平衡pH的影響

鹽度降低了三種培養(yǎng)基的平衡 pH(表 5)。鹽度是影響CO2溶解度的重要因素, 鹽度越高CO2溶解度越低[16]。CO2溶解度降低, 其分壓降低, 平衡 pH隨之降低。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最高鹽度是 34, 達(dá)到海水的鹽度。NaCl濃度由0升高到34 g/L, 三種培養(yǎng)基的平衡pH沒(méi)有大幅度變化?？梢酝茰y(cè), 如果用海水配制BG11、BBM和Zarrouk三種培養(yǎng)基, 其平衡pH稍有降低, 但是變化不會(huì)太大。也就是說(shuō), 本文研究的培養(yǎng)基主要成分對(duì)平衡 pH影響的結(jié)果, 也基本適用于海水培養(yǎng)基。

3.5 藻細(xì)胞對(duì)平衡pH的影響

在光照條件下, 藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用, 吸收利用培養(yǎng)基中的碳源, 使培養(yǎng)基pH不斷升高[15]。所以,直接測(cè)定藻細(xì)胞對(duì)平衡 pH的影響是非常困難的。從理論上分析, 藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用吸收利用培養(yǎng)基中的碳源, 使培養(yǎng)基碳源濃度降低, 平衡pH隨之降低; 藻細(xì)胞還同時(shí)吸收利用培養(yǎng)基中的氮源和磷源, 氮源濃度改變不影響培養(yǎng)基平衡 pH; 但是, 磷源濃度改變會(huì)對(duì)BG11培養(yǎng)基和BBM培養(yǎng)基的平衡pH產(chǎn)生一定的影響(表4)。所以, 藻細(xì)胞對(duì)平衡pH的影響主要是通過(guò)改變碳源、磷源等營(yíng)養(yǎng)成分的濃度間接發(fā)揮作用。

3.6 平衡pH概念的擴(kuò)展及其在微藻培養(yǎng)中應(yīng)用

平衡pH是“空氣平衡pH”的簡(jiǎn)稱, 特指培養(yǎng)基的CO2分壓與空氣中CO2的分壓平衡時(shí)的pH。以CO2為碳源培養(yǎng)微藻, 通常是將 CO2與空氣以一定比例混合[1%—5% (v/v)]后通入藻液中。利用煙道氣中的CO2為碳源培養(yǎng)微藻, CO2的比例在5%—15% (v/v)的范圍內(nèi)。顯然, “空氣平衡pH”的概念太狹窄,需要進(jìn)行擴(kuò)展。在平衡pH的前面標(biāo)明CO2的濃度(v/v), 例如“1% CO2平衡pH”, “5% CO2平衡pH”和“15% CO2平衡pH”, 分別表示培養(yǎng)基的CO2分壓與1%、5%、15%的混合氣體中CO2分壓平衡時(shí)的pH。概念擴(kuò)展后, “平衡pH”適用于任何比例的CO2混合氣體, 適用范圍更寬。

掌握了培養(yǎng)基的平衡 pH, 制定 pH調(diào)控策略,在規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中控制藻液pH不低于平衡pH, 藻液中的 CO2就不會(huì)向氣相中(CO2混合氣體)釋放,不僅可以提高微藻培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益, 而且有利于實(shí)現(xiàn)微藻CO2生物固定的環(huán)境效益。

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STUDIES ON EQUILIBRIUM PH VALUES OF MICRO ALGAL MEDIUM

ZHANG Dan1,2, ZHU Xiao-Yan1,2, WEN Xiao-Bin1,2, GENG Ya-Hong1and LI Ye-Guang1
(1. Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Speciality Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Equilibrium pH value, one of the important chemical parameter of medium, is the pH value when CO2partial pressure in the micro alga medium equals to CO2partial pressure in the air. The three mostly used medium (BG11 medium, BBM medium and Zarrouk medium) were used to study the effects of carbon, nitrogen and phosphorus concentration and salinity on the equilibrium pH value by air bubbling aeration of the medium. Our results demonstrated that the increased NaHCO3concentration in the range of 0—16.8 g/L enhanced the equilibrium pH values of all three medium. In the concentration range of 0—2.5 g/L, NaNO3had no significant effect on equilibrium pH value of these three medium. 0.1 g/L KH2PO4raised the equilibrium pH value of BG11 medium, but decreased it in BBM medium. The further increased P concentration (maximum 0.4 g/L) did not regulate the equilibrium pH value of both BG11 and BBM medium. The P concentration in the range of 0—0.4 g/L did not affect the equilibrium pH value of Zarrouk medium. The salinity in the range of 0—34 decreased the Equilibrium pH value of all three medium. Carbon concentration is the most important factor to influence the equilibrium pH value of micro algae medium, and the relationship between equilibrium pH value and carbon concentration can be described with the regression equation: y=0.3504ln(x)+8.9647 (R2=0.9708). N concentration had no significant effect on equilibrium pH value. P concentration and salinity had limited impact on equilibrium pH value. The efficiency of CO2utilization will be improved at higher pH value compared with the equilibrium pH value. These results support the environmental benefit of biofixation of CO2by micro algae.

Microalgae; Equilibrium pH value; Medium; Carbon concentration

Q93-335

A

1000-3207(2014)03-0401-06

10.7541/2014.57

2013-03-28;

2013-10-14

中國(guó)石化集團(tuán)微藻生物柴油成套技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目(No. 210080); 國(guó)家“863”項(xiàng)目(No. 2013AA065805); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. CNSF31272680)資助

張丹(1987—), 女, 山東濟(jì)寧人; 碩士研究生; 主要從事藻類學(xué)研究。E-mail: lantian0224@126.com

李夜光, E-mail: yeguang@wbgcas.cn