兔股骨頭壞死模型的血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2的表達(dá)

何志明

(佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528100)

兔股骨頭壞死模型的血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2的表達(dá)

何志明

(佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528100)

目的 建立可靠的激素性股骨頭壞死的家兔模型，探討股骨頭壞死中血管內(nèi)皮因子與和抑制凋亡基因（Bcl-2）的表達(dá)。方法 選取健康的雄性新西蘭大白兔30只，隨機(jī)分成模型組15只和對照組15只，模型組用靜脈注射脂多糖加肌內(nèi)注射地塞米松造成股骨頭壞死，對照組注射同等劑量的生理鹽水，在造模第4、8和12周時，處死動物模型，通過對壞死股骨頭的組織病理學(xué)及免疫組化技術(shù)觀察血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 隨著造模時間段的推移，股骨頭內(nèi)的血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2基因在各個組的表達(dá)量逐漸降低，與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 在聯(lián)合應(yīng)用地塞米松和脂多糖所構(gòu)建的股骨頭壞死動物模型中，股骨頭內(nèi)的血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2基因表達(dá)均受到抑制。

股骨頭壞死；血管內(nèi)皮生長因子；Bcl-2

激素性股骨頭壞死是臨床上常見的疾病，多數(shù)發(fā)生在青壯年，如果不采取合適的治療措施，患者會出現(xiàn)股骨頭塌陷以及髖關(guān)節(jié)功能障礙[1]，嚴(yán)重影響到患者的生活質(zhì)量。構(gòu)建理想的股骨頭壞死的動物實驗?zāi)Ｐ?，?探究股骨頭壞死的病因和發(fā)病機(jī)制的一種必要手段，也是開展股骨頭壞死治療的一項研究基礎(chǔ)。在總結(jié)以往成功經(jīng)驗的基礎(chǔ)上建立一個更加接近人早期股骨頭壞死的動物模型，使用大劑量的地塞米松聯(lián)合小劑量脂多糖誘導(dǎo)兔的股骨頭壞死[2]，進(jìn)而通過組織病理學(xué)及免疫組化技術(shù)探討不同的時間段Bcl-2基因表達(dá)和血管內(nèi)皮生長因子的動態(tài)改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取30只雄性的新西蘭大白兔，平均體質(zhì)量2.5～3.5 kg，隨機(jī)分組，模型組15只，對照組15組。模型組處理方法為連續(xù)2 d耳緣靜脈注射脂多糖，注射劑量為每日10 μg/kg。然后持續(xù)3 d每日按照25 mg/kg的劑量肌內(nèi)注射地塞米松，對照組則注射相同劑量生理鹽水。所有模型給予相同食物飼養(yǎng)。在構(gòu)建模型的第4、8和12周時，采用空氣栓塞方法處死模型后，立刻取下兩側(cè)的股骨頭，一側(cè)儲存在液氮罐中用來熒光PCR的檢測，另一側(cè)剖開，置于4 %福爾馬林中保存。

1.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

取出保存的一塊股骨頭標(biāo)本用5 %硝酸脫鈣處理后，石蠟包埋，HE染色[3]。利用光學(xué)顯微鏡觀察股骨頭形態(tài)學(xué)改變，然后任選3個高倍視野下取一半的攝片視野測出空骨陷窩所占到的百分比。

1.3 熒光定量PCR檢測

每時間點處死動物，取出保存好的股骨頭，將其置入無菌的研缽研成粉末狀，然后置于離心管立刻加入Trizol試劑，按Trizol方法提取模型股骨頭的總RNA，緊接著進(jìn)行純化和反轉(zhuǎn)錄。所選用的引物如下：VEGF所需引物：5'-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3'；5' -GATCCGCATGATCTGCATGGTG-3'。Bcl-2所需引物：5'-GCTACGA GTGGGATACTGGAG-3'；5'-ACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3'。

檢測方法：加入cDNA（250 ng/μL）模板2 μL，SYBR Green熒光染料10 μL，雙蒸水7 μL，引物各0.5 μL，每個反應(yīng)體系20 μL，加入PCR儀定量的專用毛細(xì)管中，放入儀器，進(jìn)行相應(yīng)的PCR反應(yīng)，不同的溫度下檢測熒光，一共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，資料全部用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t和χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

肉眼下觀察到模型組股骨頭剖面呈淺紅色，對照組的剖面呈現(xiàn)紅色。光學(xué)顯微鏡下看到模型組相比對照組軟骨下骨板較薄，骨小梁變細(xì)而且稀疏，骨小梁中看到細(xì)胞核變形，骨細(xì)胞很少見到，空骨陷窩比對照組明顯增多，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增大、增多。兩側(cè)股骨頭軟骨下區(qū)骨凹陷空虛率為：模型組為（28.04±1.68） %，對照組為（10.85± 1.28） %，兩組差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 定量熒光PCR結(jié)果

模型組在構(gòu)建模型的第4、8和12周時，模型股骨頭中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量和血管內(nèi)皮生長因子很明顯的低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和表2。

表1 模型組和對照組血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達(dá)量

表2 模型組和對照組Bcl-2 mRNA的表達(dá)量

3 討 論

股骨頭壞死可以分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩種，但是二者都有一個相似的病理變化——缺血以及缺血以后細(xì)胞死亡和修復(fù)反應(yīng)[4]，股骨頭壞死大多數(shù)是從死骨的邊界和四周有活性的組織結(jié)合部位開始修復(fù)，主要表現(xiàn)在血管再生、新骨生成和死骨的吸收。然而隨著死骨修復(fù)向中央發(fā)展，死骨的吸收程度加強(qiáng)，明顯的減弱的是新骨生成與血管修復(fù)。血管內(nèi)皮生長因子主要能夠特異性地對血管生成的前一個階段起到相應(yīng)作用，能夠促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的形成[5]。血管內(nèi)皮生長因子是在牛的垂體中濾泡星形細(xì)胞的體外培養(yǎng)液里分離出來由Ferrara等學(xué)者于1989年發(fā)現(xiàn)的，血管內(nèi)皮生長因子主要的生物學(xué)功能為誘導(dǎo)血管生成，具有強(qiáng)烈的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)有絲分裂作用，還具有改變血管內(nèi)皮的某些基因的表達(dá)、增加血管通透性以及促使組織因子從血管內(nèi)皮分泌等作用。Suzuki等[6]也已經(jīng)闡明血管內(nèi)皮生長因子具有促進(jìn)股骨頭壞死局部的區(qū)域中的新血管生成。細(xì)胞凋亡也可發(fā)生于激素性股骨頭壞死，Bcl-2通過阻斷細(xì)胞凋亡信號傳遞從而抑制細(xì)胞凋亡。

通過對壞死股骨頭的組織病理學(xué)及免疫組化技術(shù)觀察，在聯(lián)合應(yīng)用地塞米松和脂多糖所構(gòu)建的股骨頭壞死動物模型中，股骨頭內(nèi)的血管內(nèi)皮生長因子和Bcl-2基因表達(dá)均受抑制。

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[2] 孔令擘,牛舜,楊重非,等.兔股骨頭缺血壞死模型的建立研究及比較[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(2):138-140.

[3] Alter J.Nontraumatic vascular necrosis of the femoral head:past, present and future[J].Clin Orthop,1992(277):12-21.

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