皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中p33ING1蛋白的表達(dá)

姚 瑩

（河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，河南 洛陽(yáng) 471000）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中p33ING1蛋白的表達(dá)

姚 瑩

（河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，河南 洛陽(yáng) 471000）

目的 研究p33ING1基因表達(dá)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)我科在1999年～2004年35例皮膚鱗狀細(xì)胞癌及25例原位鱗癌（Bowen病）組織中的p33ING1表達(dá)情況。結(jié)果 皮膚鱗狀細(xì)胞癌p33ING1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為42.9%（15/35），明顯低于正常組的82.9%（29/35），二者比較有明顯差異性，χ2=11.99，P＜0.05。其原位鱗癌中陽(yáng)性表達(dá)為14(56%），同樣明顯低于正常組織的陽(yáng)性率82.9%（29/35），二者比較有明顯差異性，χ2=5.18，P＜0.05。結(jié)論 p33ING1蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)下降，提示p33ING1蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、進(jìn)展有重要意義，并有可能成為腫瘤檢測(cè)蛋白之一。

基因；鱗狀細(xì)胞癌；皮膚；免疫組化

近年來(lái)我國(guó)癌癥發(fā)病人數(shù)持續(xù)增多，嚴(yán)重降低了國(guó)內(nèi)群眾的健康水平，對(duì)癌細(xì)胞病變情況深入研究是很有必要的。臨床研究證明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素包括原癌基因的活化與抑癌基因的失活，其中抑癌基因可能是抵制腫瘤發(fā)生的重要保護(hù)機(jī)制[1]。醫(yī)學(xué)理論提出采用抑癌基因?qū)Π┌Y病況進(jìn)行綜合處理，ING1基因是臨床癌細(xì)胞研究中提出的新基因，其對(duì)一些癌細(xì)胞組織具有顯著的抑制作用[2,3]?？紤]到ING1抑癌基因又不一樣類別的啟動(dòng)隱私，需針對(duì)某一種展開(kāi)研究才能獲得理想的結(jié)果[4]。本研究即探討ING1（In nibitor of growth 1）抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物p33ING1蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起到的作用及與皮膚鱗癌臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

取自2007年～2012年在我科手術(shù)切除并行組織病理檢查的正常皮膚組織35例、原位鱗癌（Bowen病）皮膚組織25例及皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮膚組織35例。其中男38例，女22例。年齡32～80歲，平均年齡56歲。28例發(fā)生于顏面部，5例發(fā)生于手背，2例發(fā)生于下唇。

1.2 抗體

羊抗人 p33ING1（C-19）多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，工作濃度為1?100；SP試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 組織標(biāo)本的制備

將組織標(biāo)本（正常皮膚組織、原位鱗癌皮膚組織及鱗狀細(xì)胞癌皮膚組織）經(jīng)福爾馬林固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，4 ℃保存，4 μm厚連續(xù)切片。

1.4 HE染色

切片常規(guī)脫蠟入水后水洗，蘇木色精室溫下染色1 min，1%鹽酸酒精分色3 s，1%氨水返藍(lán)5 min，伊紅室溫下復(fù)染5 min，再遞度脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 免疫組化

按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，切片脫蠟入水后，PBS水洗3次，每次5 min，3%H2O2室溫孵育15 min，PBS水洗3次，每次5 min，微波抗原修復(fù)95～98 ℃ 15 min，自然冷卻，正常封閉血清室溫下孵育15 min，甩干；加入一抗工作液37 ℃下孵育2 h（空白對(duì)照片不加一抗，余不變），PBS漂洗3次，每次5 min，擦干，加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃下孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，擦干，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素37 ℃下孵育15～20 min，使其與二抗的標(biāo)記生物素充分結(jié)合，PBS漂洗3次，每次5 min，DAB室溫下顯色，鏡控反應(yīng)時(shí)間（約3 min），蒸餾水充分沖洗中止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染胞核，染色1 min，1%氨水返藍(lán)5 min，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

圖1 p33ING1在正常皮膚組織中的高表達(dá)，可見(jiàn)基底層細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于上層細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá) ×200

圖2 p33ING1在鱗癌中的低陽(yáng)性表達(dá) ×100

圖3 p33ING1在鮑溫病中的低陽(yáng)性表達(dá) ×200

1.6 陽(yáng)性結(jié)果的判定

于5個(gè)（×200）不同高倍鏡視野相同范圍下計(jì)數(shù)免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞的平均百分比，陽(yáng)性細(xì)胞率＜25%計(jì)為陰性（-），25%～50%為陽(yáng)性（+）、50%～75%為（++），＞75%為（+++）[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

P33ING1在正常皮膚、原位鱗癌、及鱗癌中均定位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1～3。根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)可得到正常皮膚組織、原位鱗癌、皮膚鱗癌組織中的陽(yáng)性患者百分比分別為82.9%、56%、42.9%，見(jiàn)表1。正常皮膚組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于原位鱗癌和皮膚鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（P＜0.05）。

表1 P33ING1蛋白的在皮膚鱗癌中的表達(dá)

3 討 論

癌癥已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)界研究的焦點(diǎn)內(nèi)容，每年全球癌癥人數(shù)病死率不斷增多，嚴(yán)重威脅了人類生存的安全性。世界醫(yī)學(xué)研究組織發(fā)現(xiàn)，癌癥治療不能僅僅依賴于藥物使用或化學(xué)治療，還需從病理學(xué)上分析癌癥細(xì)胞組織的變化情況，為人工提供更加科學(xué)的治療方案，才能奠定最終的治療效果。從臨床研究情況看，抑制基因是傳統(tǒng)癌癥治療外的新方式，其結(jié)合理論研究機(jī)制對(duì)癌癥病況進(jìn)行綜合處理，大大抑制了癌癥病況的發(fā)生率。按照現(xiàn)有醫(yī)學(xué)研究成果，癌癥細(xì)胞受到基因組織驅(qū)動(dòng)的影響，常在某個(gè)階段發(fā)生基因組織突變等問(wèn)題，使癌細(xì)胞組織呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)。p53是一種比較典型的抑癌基因，其作用機(jī)制不能單獨(dú)地完成，而是要結(jié)合抑癌基因——ING1才能發(fā)揮作用，這是臨床抑癌研究的重要成果[5]。依據(jù)最終的研究數(shù)據(jù)，表面ING能夠?qū)?xì)胞增值增長(zhǎng)具有抑制作用，加快了癌細(xì)胞的病死率，達(dá)到了抑制癌變的作用[6,7]。

進(jìn)一步研究表明，p33ING1并非在獨(dú)立條件下形成抑癌功能，其所以能夠發(fā)揮出抑癌基因作用[7]，與p53之間有著不可分割的關(guān)系，彼此之間相互依賴才產(chǎn)生了醫(yī)學(xué)病例作用。一般情況下，可以先對(duì)p21/ WAFI給予激活處理，再借助細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程達(dá)到反饋的，為細(xì)胞組織分析提供了可靠的參照數(shù)據(jù)。在反饋?zhàn)饔冒l(fā)生同時(shí)，p21/WAFI也能夠?qū)53產(chǎn)生刺激，使得p33ING1起到應(yīng)有的抑癌功效。從功效機(jī)制來(lái)看，p33ING1會(huì)表現(xiàn)出各種表達(dá)形式，特別是在異常狀態(tài)下則無(wú)法抑制基因細(xì)胞的死亡，這是癌癥腫瘤形成的一個(gè)主要因素。經(jīng)過(guò)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，最后得出p33ING1、p53等必須在相互輔助的條件下，才能對(duì)癌癥發(fā)揮出抑制的效果，大大降低了患者癌變的發(fā)生率[5]。

本次皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織研究發(fā)現(xiàn)，p33ING1的組織表達(dá)率有明顯的變化，具體情況：正常皮膚（82.9%）、原位皮膚鱗癌（56%）、皮膚鱗癌組織（42.9%），整體上在不斷地減小，這說(shuō)明了p33ING1參與癌細(xì)胞抑制的效果顯著，可從多個(gè)方面抑制癌細(xì)胞病變的發(fā)生率。由于當(dāng)前醫(yī)療水平的局限性，對(duì)p33ING1在癌細(xì)胞病變抑制中作用的研究不夠深入，p33ING1所具有的其他功能尚未被發(fā)現(xiàn)，這是未來(lái)醫(yī)學(xué)研究需深入探討的內(nèi)容。本研究尚未研究p33ING1與皮膚鱗癌分級(jí)之間的關(guān)系，從而可以推測(cè)p33ING1的表達(dá)與病理分級(jí)及患者預(yù)后的關(guān)系。由于本實(shí)驗(yàn)收集的為過(guò)去幾年的病理蠟塊，對(duì)這些病例的隨訪仍在進(jìn)行中，所以對(duì)p33ING1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的預(yù)后及轉(zhuǎn)移方面的作用，有待于進(jìn)一步的研究。

[1] Oren M.Tumorsuppression.Teaming up to restrain cancer[J].Nature, 1998,391(6664):233-234.

[2] Garkavt I,Kazarov A,Gudkov K,et al.Supression of the novel growth inhibtor p33ING1 promotes neeoplastic transformation[J]. Nat Genet,1996,14(4):415-420.

[3] Garkavt I,Boland D,Mai J,et al.Specific monoclonal antibody raised against the p33ING1,tumors supressor [J].Hybridoma,l997, 16(6):537-540.

[4] Gibson UE,Heid CA,Williams PM.A novel method for real time quantitative RT-PCR[J].Genome Res,1996,6(10):995-1001.

[5] Garkavtse VL,Grigorian IA,Ossovskaya VS,et al.The candidate tumor suppressor P33lNGI cooperates with P53 in cell growth control[J].Nature,1998,391(6664):295-298.

[6] IGor G,Karl R.Extention of the replicative life span of human diploid flbroblasts by inhibition of the p33lNGl candidate tumor suppressor[J].Mol Cell Biol,1997,17(4):2014-2019.

[7] Helbing G,Veillette C,Riabowol K,et al.A novel candidate tumor supppressor,ING1,is involved in the regulation of apoptosis[J]. Cancer Res,1997,57(7):1255-1258.

p33ING1Gene Expression in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

YAO Ying
(Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China)

Objective To investigate the expression of p33ING1protein rate in skin squamous cell carcinoma and their clinical significance. Methods All samples of normal and cancer tissues from 95 patients were detected for their protein expression levels of p33ING1with the SP immunohistochemical staining. Results The positive rate of p33ING1in cutaneous squamous cell carcinoma was 42.9%, significantly lower than that of normal skin tissue 82.9%, P＜0.05. The expression of p33ING1was lower in Bowen disease tissues (56%) than that of normal tissues (82.9%). Conclusion The low expression of p33ING1in carcinoma may be important fators related to carcinogenesis, development of cutaneous squamous cell carcinoma.

Gene; Squamous cell carcinoma; Skin; Immunohistochemistry

R739.5

：B

：1671-8194（2014）07-0058-02