菜籽凝血酶抑制肽的酶法制備研究

王子偉，章紹兵，陸啟玉，胡存書，李宇波

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

凝血是機體重要的生理防御過程，可誘發(fā)血栓，其導(dǎo)致的病理性血栓可引發(fā)如肺梗塞、腦血栓、視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病，嚴(yán)重危害著人類的生命健康.凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血過程中起關(guān)鍵作用，因此，凝血酶可以作為抗凝治療的理想靶點，通過抑制凝血酶的活性可以有效地阻礙凝血過程的發(fā)生[1].目前，一些肽類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗凝血活性，按抗凝血活性肽的來源不同可將其分為非食物源肽和食物源肽兩大類，其中非食物源抗凝肽已有較長的研究歷史，而食物源抗凝肽的研究近年來才引起廣泛的關(guān)注.

油菜是世界上僅次于大豆的第二油料作物，我國油菜產(chǎn)量居世界首位.菜籽粕是菜籽油加工過程中的主要副產(chǎn)物，其蛋白含量30%～45%.菜籽蛋白氨基酸組成合理，與WHO/FAO 推薦的氨基酸組成模式相近，是一種優(yōu)良的植物蛋白.菜籽蛋白肽一般是菜籽蛋白經(jīng)過蛋白酶水解作用后，再經(jīng)特殊處理得到的產(chǎn)物.與菜籽分離蛋白相比，菜籽蛋白肽的溶解性、起泡性及起泡穩(wěn)定性均優(yōu)于菜籽分離蛋白[2]，同時菜籽蛋白肽還具有多種生物活性[3-8]，因此值得進一步開發(fā)利用.

作者從冷榨制油獲得的菜籽餅中提取出菜籽蛋白，研究多種蛋白酶對菜籽蛋白的水解特性，以及水解產(chǎn)物抑制凝血酶的活性；并對采用最優(yōu)酶種制備菜籽凝血酶抑制肽的工藝條件進行了優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨菜籽餅（水分13.2%，蛋白質(zhì)33.3%，粗脂肪13.7%）：湖北楚福油脂有限公司贈送.2709 堿性蛋白酶：北京東華強盛生物科技有限公司，實測酶活135 000 U/g，廠家推薦最適條件：溫度60 ℃、pH 8.5.Alcalase 2.4L：諾維信（中國）生物科技有限公司，實測酶活154 000 U/mL，廠家推薦最適條件：溫度50 ℃、pH 8.5.Protex 6L：杰能科（無錫）生物工程有限公司，實測酶活123 000 U/mL，廠家推薦最適條件：60 ℃、pH 8.5.Protex 7L：杰能科（無錫）生物工程有限公司，實測酶活67 000 U/mL，廠家推薦最適條件：50 ℃、pH 7.5.Neutease 1.5MG：諾維信（中國）生物科技有限公司，實測酶活89 000 U/g，廠家推薦最適條件：50 ℃、pH 7.5.凝血酶：索萊寶（北京）生物科技有限公司.纖維蛋白原：Sigma公司.其他試劑均為分析純.

1.2 主要儀器與設(shè)備

FW-200 高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TD5-4B 離心機：北京時代北利離心機有限公司；DW-2 無級恒速攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LGJ-10C 型四環(huán)凍干機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；RT-6000 酶標(biāo)儀：Rayto 公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽蛋白的制備

菜籽餅經(jīng)粉碎機粉碎，使用石油醚索氏抽提15 h 脫油，室溫晾干去除溶劑得到菜籽粕；將菜籽粕以1∶15（g/mL）加入蒸餾水中，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為12，40 ℃下攪拌1.5 h；然后4 000 r/min 離心10 min，收集上層清液；上清液用1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4.5 使蛋白質(zhì)等電點沉淀，靜置1 h 后4 000 r/min 離心10 min，水洗沉淀2～3 次，得到菜籽蛋白，冷凍干燥（蛋白質(zhì)含量為85.1%），收集備用.

1.3.2 蛋白酶活力的測定

參照GB/T 23527—2009 蛋白酶制劑.

1.3.4 蛋白酶酶解菜籽蛋白

準(zhǔn)確稱取3.0 g 菜籽蛋白，溶解于100 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)酶解溫度和pH（堿性蛋白酶2709，60 ℃，pH 8.5；Alcalase 2.4L，60 ℃，pH 8.5；Protex 6L，60℃，pH 8.5；Protex 7L，50 ℃，pH 7.5；Neturase 1.5 MG，50 ℃，pH 7.5），加入5 000 U/g 蛋白酶，開始計時；同時在水解過程中加入0.1 mol/L 的NaOH維持pH 值恒定；每10 min 記錄一次耗堿量，酶解1.5 h.反應(yīng)結(jié)束后將水解物于100 ℃加熱15 min鈍化蛋白酶，待其自然冷卻后以4 500 r/min 離心15 min，收集上清液，置冰箱中備用.

1.3.5 菜籽蛋白質(zhì)水解度測定

采用pH-stat 法，通過下式計算水解度[9].

式中：V 為NaOH 溶液消耗體積，mL；C 為NaOH 溶液濃度，mol/L；m 為菜籽蛋白樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；h 為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，h=7.8 mmol/g[3]；T 為試驗溫度，K.

1.3.6 菜籽蛋白水解物凝血酶抑制率測定

采用酶標(biāo)儀法[10-11]，將酶標(biāo)儀的溫度設(shè)定為37 ℃，測定波長設(shè)定為405 nm.纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液均以Tris-HCl 緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2）配制.向酶標(biāo)板的小孔中加入140 μL 0.1%（W/V）纖維蛋白原溶液和40 μL 樣品溶液，混勻后讀數(shù)（ASB）.再加入10 μL 凝血酶溶液（12 U/mL）開始反應(yīng)，10 min 后讀數(shù)（AS）.取40 μL Tris-HCl 緩沖液代替樣品溶液，其他操作同樣品管，測得吸光值（ACB和AC）.按下式計算樣品抑制凝血酶催化纖維蛋白原形成纖維蛋白的能力.

1.3.7 酶解條件對菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影響

在1.3.4 基礎(chǔ)上，選取優(yōu)勢酶，分別考察酶解溫度、pH、加酶量和酶解時間對菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影響.

1.4 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以兩次以上結(jié)果的平均值表示，并使用SPSS 16.0 for Windows 軟件進行單因素方差分析，p＜0.05 代表差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解菜籽蛋白

采用不同蛋白酶在各自最適條件下酶解菜籽蛋白（底物濃度為3.0 g/100 mL），其水解度隨時間的變化如圖1 所示.

圖1 不同蛋白酶酶解菜籽蛋白的水解度隨時間的變化

由圖1 可知，盡管所用蛋白酶的種類不同，但都在前10 min 顯示了最大的水解速率；隨著反應(yīng)時間的延長，水解度變化減緩.雖然反應(yīng)體系中加入酶活力的量是相同的，但是不同種類蛋白酶對菜籽蛋白水解度的影響有顯著差別.堿性蛋白酶2709、Alcalase 2.4L、Protex 6L 的水解度明顯高于中性蛋白酶Protex 7L 和Neturase 1.5MG，說明堿性蛋白酶對菜籽蛋白的酶解效率要遠(yuǎn)高于中性蛋白酶，原因可能與在堿性體系中菜籽蛋白的溶解性更好有關(guān).

不同蛋白酶酶解反應(yīng)1.5 h 后，酶解液的凝血酶抑制率如圖2 所示，其中空白為未加入蛋白酶的菜籽蛋白溶液.由圖2 可知，酶解反應(yīng)提高了菜籽蛋白的凝血酶抑制率，說明酶解液中存在可以抑制凝血酶催化纖維蛋白原反應(yīng)的產(chǎn)物；但是，不同蛋白酶的酶解液對凝血酶的抑制率不同，其中Alcalase 2.4L 的抑制率最高，達到80%左右.盡管堿性蛋白酶2709 和Alcalase 2.4L 酶解液的水解度十分接近，但前者的凝血酶抑制率卻較低.所以，本試驗選取Alcalase 2.4L 制備菜籽凝血酶抑制肽.

圖2 不同菜籽蛋白酶酶解液的凝血酶抑制率

2.2 Alcalase 2.4L 酶解制備菜籽凝血酶抑制肽的條件優(yōu)化

2.2.1 酶解溫度對菜籽蛋白質(zhì)水解度和凝血酶抑制率的影響

在底物濃度3.0 g/100 mL，加酶量5 000 U/g，pH 8.5，溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的條件下酶解菜籽蛋白，酶解過程中加入0.1 mol/L NaOH維持pH 恒定，反應(yīng)1.5 h；反應(yīng)結(jié)束記錄總耗堿量并測定產(chǎn)物的抗凝活性，通過計算得到溫度對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響，見圖3.

圖3 溫度對菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影響

由圖3 可知，隨著溫度的升高，水解度不斷上升，但當(dāng)溫度升至55 ℃后，隨著溫度的升高水解度反而下降，可能溫度升高使蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生了變化，影響到酶與蛋白的結(jié)合.在試驗范圍內(nèi)凝血酶抑制率總體隨溫度變化不大，45 ℃酶解時抑制率較低，而60 ℃時結(jié)果偏高.同時在60 ℃酶解液的水解度并不是最高，為避免蛋白水解度較高可能會帶來味苦的問題，選取酶解溫度60 ℃較為合適.

2.2.2 酶解pH 對菜籽蛋白質(zhì)水解度及凝血酶抑制率的影響

在底物濃度3.0 g/100 mL，加酶量為5 000 U/g，反應(yīng)溫度60 ℃，pH 分別為8、8.5、9、9.5、10 的條件下進行酶解，酶解過程中加入0.1 mol/L NaOH維持pH 恒定，反應(yīng)1.5 h；反應(yīng)結(jié)束記錄總耗堿量并測定產(chǎn)物的抗凝活性，通過計算得到pH 對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響，見圖4.

圖4 pH 對菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影響

如圖4 所示，當(dāng)pH 為9.5 時，菜籽蛋白的水解度最高，過高或過低的pH 均會抑制蛋白酶的活性，使水解度下降.在所有酶解pH 中，pH 值為8.5時酶解液的凝血酶抑制率最高，故選擇酶解最佳pH 為8.5.菜籽肽凝血酶抑制率與水解度之間沒有明顯關(guān)系，即高水解度對應(yīng)的抑制率不一定最高（這在前面的試驗結(jié)果中也有所體現(xiàn)）.實際上，水解度較低時，蛋白水解不完全，可能會導(dǎo)致部分抗凝血活性較強的多肽不能被水解出來；而過度水解可能會導(dǎo)致部分抗凝血活性較強的多肽被水解為寡肽，造成了抗凝血活性的削弱.因此不能簡單地認(rèn)為菜籽蛋白水解度越大，抗凝血活性越強.

2.2.3 加酶量對菜籽蛋白質(zhì)水解度及凝血酶抑制率的影響

在底物濃度3.0 g/100 mL，反應(yīng)溫度60 ℃，pH 8.5，在加酶量分別為3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g 的條件下進行酶解，酶解過程中加入0.1 mol/L NaOH 維持pH 恒定，反應(yīng)1.5 h；反應(yīng)結(jié)束記錄總耗堿量并測定產(chǎn)物的抗凝活性，通過計算得到加酶量對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響，見圖5.

圖5 加酶量對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響

從圖5 可以看出，在試驗范圍內(nèi)，水解度隨加酶量的增加而增加，當(dāng)加酶量超過5 000 U/g 時，水解度增加趨緩；凝血酶抑制率隨加酶量的變化較為復(fù)雜，加酶量在4 000 U/g 時抑制率最低，而在7 000 U/g 時，抑制率最高，約為90%.從經(jīng)濟成本角度考慮，沒有選擇更高的加酶量進行試驗，最終選擇最適加酶量為7 000 U/g.

2.2.4 酶解時間對菜籽蛋白質(zhì)水解度和凝血酶抑制率的影響

在底物濃度3.0 g/100 mL，加酶量為7 000 U/g，反應(yīng)溫度60 ℃，pH 8.5 的條件下進行酶解，酶解過程中加入0.1 mol/L NaOH 維持pH 恒定，分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，反應(yīng)結(jié)束記錄總耗堿量并測定產(chǎn)物的抗凝活性，通過計算得到酶解時間對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響，見圖6.

圖6 酶解時間對菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影響

由圖6 可知，水解度隨著酶解時間的延長逐漸增大，但從1.5 h 起增長趨于平緩.同時，抑制率也隨酶解時間的延長逐漸增加，在2.0 h 達到最高，而進一步延長酶解時間（水解度基本無變化）凝血酶抑制率卻有明顯降低.這說明菜籽蛋白酶解到一定程度后，反應(yīng)時間進一步延長（超過2.0 h），菜籽蛋白的水解度即使變化很小（即菜籽肽的分子質(zhì)量變化很?。矔甬a(chǎn)物抑制凝血酶活性發(fā)生較大的變化.因此在制備菜籽抗凝血肽時，反應(yīng)時間需要嚴(yán)格控制.本試驗最終選定酶解時間為2.0 h，此時酶解液的凝血酶抑制率可達到98.8%，菜籽酶解液的水解度為18.1%.

通過工藝條件優(yōu)化后得到的菜籽蛋白酶解液具有顯著的凝血酶抑制活性，但因為菜籽粕中含有較多酚類物質(zhì)，致使制備的酶解液顏色較深，直接作為功能飲料的配料使用存在一定的局限性，可以考慮通過活性炭或大孔樹脂等較為成熟的手段將其脫色后再進行應(yīng)用.

3 結(jié)論

通過比較不同蛋白酶對菜籽蛋白水解度以及水解產(chǎn)物凝血酶抑制活性的影響，篩選出最適合制備菜籽凝血酶抑制肽的酶種為Alcalace 2.4L.在此基礎(chǔ)上探討了堿性蛋白酶Alcalace 2.4L 酶解菜籽蛋白的相關(guān)條件及酶解產(chǎn)物的抗凝血活性，確定Alcalace 2.4L 酶解菜籽蛋白制備凝血酶抑制肽的工藝條件：底物濃度為3.0 g/100 mL、溫度60℃、pH 8.5、加酶量為7 000 U/g、酶解時間2 h，在此條件下菜籽蛋白酶解液的凝血酶抑制率可達到98.8%.

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