顯微鏡景深拓展技術(shù)研究

張 平，吳嘉敏，林靖宇，劉燁斌

(1.清華大學(xué) 自動化系，北京 100084；2.江蘇北方湖光光電有限公司，江蘇 無錫 214035)

引言

光學(xué)顯微鏡從發(fā)明至今已有四百多年的歷史，伴隨著人類科技的發(fā)展，不斷演化進步。普通光學(xué)顯微鏡的放大倍率已可超過1 000倍，并具有明場、暗場、偏振、熒光、相差、微分干涉、數(shù)字全息等多種類型，由簡單的手動目視觀察演變?yōu)檎吓恼铡z像、處理、電控等多種功能的強大光學(xué)儀器。

在顯微鏡功能越來越強大、越來越人性化的同時，人們對它也在不斷提出新的要求，但目前顯微鏡還在很多方面有局限性，主要體現(xiàn)在：1) 空間分辨率受波動特性限制提高困難；2) 顯微鏡景深小，尤其是在高分辨率和大數(shù)值孔徑的條件下，微小的離焦就會造成目標(biāo)丟失。

分辨率是由電磁波特性決定的，更換探測波段可以提高分辨率，如掃描電子顯微鏡，但對于光學(xué)波段的顯微鏡而言橫向分辨率的提高進展較為緩慢。隨著生命科學(xué)的高速發(fā)展，對于高性能的大景深三維立體顯微的需求日益迫切，這對大量已應(yīng)用的光學(xué)顯微鏡是一種挑戰(zhàn)。受顯微成像原理的限制，在獲取高橫向分辨率的同時會丟失掉縱向分辨率，因此如何增大顯微景深，使三維立體顯微更具應(yīng)用價值，創(chuàng)造出新型設(shè)備儀器成為了光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域的一個研究熱點。

對于提高景深的研究在光學(xué)領(lǐng)域從來就沒有停止過[1-2]，其中不乏有很多新的思路和方式，也取得了許多研究進展與成果。在顯微光學(xué)中，就各種方法所獲取到的景深拓展效果來看，要形成大的三維立體顯微還需要做很多研究工作。在傳統(tǒng)顯微鏡的模式下，通過一些部件變形可獲取一定景深拓展，如：將球差故意引入顯微鏡頭設(shè)計中[3]，改變顯微鏡的出瞳函數(shù)形式[4-5]，但這些獲取的景深深度有限。

在顯微成像領(lǐng)域中，更多的是在通過掃描成像、空間光調(diào)制、波前編碼及應(yīng)用光場來進行顯微景深的提高研究。這些方法都能夠形成大的景深范圍，如掃描成像的光學(xué)切片技術(shù)，理論上可對“任意”厚度的樣品進行聚焦處理，空間光調(diào)制、波前編碼等方法可以獲取大于1個數(shù)量級的景深提升，而應(yīng)用光場則可提高至2個數(shù)量級。在這些方法中，盡管都獲取了景深的大幅提升，但由于自身技術(shù)的限制和不完善，目前都有些局限性，它們總是在犧牲效率、設(shè)備體積和橫向分辨率等，因而需要更多新的技術(shù)應(yīng)用到其研究中。這些技術(shù)帶來的大景深效應(yīng)可以在生命科學(xué)研究中對大尺度的三維目標(biāo)進行有效的觀察，有些可以進行活體快速運動觀察，光場顯微還可進行多視角立體觀察，形成全面的顯微探測。

大景深顯微成像作為一個實際需求牽引的技術(shù)，經(jīng)幾十年發(fā)展已取得一定成效，有些已應(yīng)用到顯微鏡生產(chǎn)中，相信在不久將來會在實際工作中得以應(yīng)用。計算攝像(computational photography)是近年在國際上興起的一門新學(xué)科，在超分辨率成像、瞬態(tài)成像、拐角成像、散射介質(zhì)成像、深度獲取、去模糊等方面已經(jīng)獲得了巨大的成功，其通過前端采集和后端計算處理，可實現(xiàn)常規(guī)光學(xué)成像系統(tǒng)無法實現(xiàn)的多維信息獲取。在顯微鏡景深拓展方面，計算攝像也發(fā)揮著巨大的作用，通過體掃描、空間光調(diào)制、波前編碼及光場等手段，采用計算方式可有效拓展出大顯微景深圖像。國內(nèi)在顯微鏡大景深方面集中在波前編碼和空間光調(diào)制器上，主要研究單位有西安光機所[19，24]、清華大學(xué)[23]、浙江大學(xué)[5]、上海理工大學(xué)[30]、哈爾濱工業(yè)大學(xué)[29]等。

本文以光學(xué)顯微鏡為研究對象，就其近年發(fā)展的大景深顯微成像技術(shù)進行了綜合、全面的闡述，主要對光學(xué)切片掃描、空間光調(diào)制、波前編碼及光場進行了分節(jié)介紹與論述，并就其技術(shù)發(fā)展提出觀點。

1 掃描成像

1.1 切片掃描

在不改變現(xiàn)有顯微鏡顯微成像的原理條件下，增大顯微圖像景深的通常做法是對樣品進行不同厚度位置的掃描，并采集形成序列圖像，以一定的規(guī)則進行融合，通過計算重建出一幅大景深圖像。

通過載物臺或者光學(xué)系統(tǒng)移動的方法可在不對顯微鏡進行大的原理改變情況下，獲取滿足一定需要的大景深圖像。該方法獲取移動范圍內(nèi)的圖像切片序列，重建的大景深圖像是掃描時間內(nèi)的切片集合。若要獲取大景深及高縱向分辨率圖像，系統(tǒng)需要在掃描、計算上消耗大量時間。因此，該方法更適合于靜態(tài)樣本的觀察，無法應(yīng)用于活體樣本。

構(gòu)建快速掃描大景深顯微鏡可有效提高系統(tǒng)的適用性。通過類似共聚焦原理在顯微后端搭建一套與前端成像一致的系統(tǒng)[6]，通過與物面共軛的反射鏡快速移動使成像物面在軸向快速移動，形成掃描，輸出實時圖像。該方法的掃描頻率可達到1kHz以上，但成像速度受制于高分辨率CCD的幀速度。也可在CCD成像光路中插入電動可調(diào)諧透鏡，并進行對焦面的快速掃描，用以進行數(shù)據(jù)記錄，速度可達到30 Hz[7]。

切片掃描的重建方法可分成空域法和頻域法?？沼蚍ㄊ菍γ恳环鶊D像進行清晰和模糊分類，并將清晰部分進行融合圖像處理形成大景深圖像[8-10]，目前已有很多實現(xiàn)合成全聚焦圖像的軟件，更多的研究在于清晰與模糊區(qū)的算法分析[11]；頻域方法是利用清晰圖像所具有的高頻信息與模糊圖像的差異性來進行區(qū)分與融合[12-14]。

切片掃描保持了顯微鏡原有的高橫向分辨率優(yōu)勢，并拓展了縱向分辨率，是一種經(jīng)濟、便利、有效的景深拓展方法。

1.2 體掃描

對于顯微應(yīng)用尤其是活體觀察，希望能夠盡快獲取全景深的圖像信息，盡管切片掃描中有了一些快速成像技術(shù)，但離真正的“實時”成像還有些距離，因此通過一次曝光即可實現(xiàn)大景深圖像顯示顯得極具誘惑，這可以通過光學(xué)體掃描技術(shù)來實現(xiàn)。光學(xué)體掃描即在相機曝光期間快速變化物面位置，形成一個高速掃描區(qū)，獲取的圖像融合了“無數(shù)”的顯微物鏡聚焦切片圖像，通過去卷積可反演得到清晰的大景深、高分辨率圖像。相比于切片掃描，體掃描在一次曝光期間即可完成所有采樣工作，可實現(xiàn)“無縫”融合與強實時性。

具體方法為：在普通生物光學(xué)顯微鏡后端安放一可控小型液體透鏡作為快速、連續(xù)的變焦元件，實現(xiàn)CCD單次曝光期間的快速變焦[15]。模型計算表明，顯微鏡的點擴散函數(shù)在一個相當(dāng)長的變焦距離內(nèi)保持不變。圖1給出了不同離焦距離處的傳統(tǒng)顯微鏡與體掃描顯微的點擴散函數(shù)對比情況。

體掃描顯微實驗采用10倍放大倍率、0.25數(shù)值孔徑的顯微物鏡，液體透鏡反應(yīng)速度約10 ms，樣品尺寸5 μm～30 μm，實驗結(jié)果如圖2所示。圖2中(a)、(b)為傳統(tǒng)顯微鏡在前端、后端清晰位置處的圖像，(c)為獲取的體掃描圖像，(d)為處理后的圖像。實驗獲取的顯微景深約為160 μm，且成像質(zhì)量與傳統(tǒng)顯微鏡保持一致。但是這一方法對于顯微物鏡的要求較高，各類實驗都集中在低倍率下。相位梯度圖像的研究也進一步表明了單次曝光獲取大景深的可行性與意義[16]。

圖2 體掃描與傳統(tǒng)顯微鏡景深對比Fig.2 Comparison of depth of field between volumetric optical scaning and conventional microscope

2 波前編碼

波前編碼成像技術(shù)是由Cathey和Dowski[17]首先提出的一項用于擴大焦深的處理技術(shù)，近年來國際上眾多學(xué)者對該技術(shù)進行了研究，現(xiàn)已有各種實現(xiàn)形式。波前編碼的主體思想是在光學(xué)系統(tǒng)的出瞳，通過改變出瞳處的光波波面相位，使得光學(xué)系統(tǒng)的點擴散函數(shù)或光學(xué)傳遞函數(shù)變得與焦點所在的位置無關(guān)，在焦點前后均保持了相同的函數(shù)描述形式，且系統(tǒng)截止頻率范圍內(nèi)的調(diào)制傳遞函數(shù)沒有出現(xiàn)零點。因此，通過獲取的與離焦量無關(guān)的模糊圖像與先驗?zāi)０逍畔⑦M行解卷積，即可恢復(fù)出整個場景的清晰圖像，且該圖像具有大景深的特點。

波前編碼的核心在于如何設(shè)計出一個最佳的相位模板，由于不同的模板具有不同的特性，所產(chǎn)生的點擴散函數(shù)與焦距位置的敏感性也不相同，因此在最初的三次掩膜板[17-18]提出后，研究了數(shù)型模板[19]、高階型模板[20]、多項式模板[21]、指數(shù)型模板[22]、自由形式模板[23]、正弦型模板[24]等。多數(shù)模板由于存在著點擴散函數(shù)的移動效應(yīng)，使得理論設(shè)計值與實際值之間存在著失配情況，這就需要進行模板優(yōu)化研究，設(shè)計更為復(fù)雜但更加合適的復(fù)合模板[25-26]，并采用新的評價方式[27-28]。

該方法的優(yōu)點是在不降低系統(tǒng)分辨率的情況下，僅需一次曝光即可將顯微景深擴大至1個量級以上。同時，由于無需要精確的焦點位置，因此該方法可抑制各種離焦類誤差，如球差、色散[18]、溫變[29]及裝配誤差，大大增加了顯微系統(tǒng)的冗余度，降低了系統(tǒng)的高精度設(shè)計要求與成本。波前編碼技術(shù)很好地解決了大景深與高成像質(zhì)量互為矛盾的兩難處境，在顯微鏡領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力，且在一些其他領(lǐng)域中也已應(yīng)用。

相位模板在應(yīng)用到顯微鏡時最為根本的目的是為了提高點擴散函數(shù)在焦點附近的非敏感量，從而提高系統(tǒng)的景深。除理論計算外，通過實驗進行驗證，可以得出不同的模板、出瞳形式有著略微差異的景深和光學(xué)傳遞函數(shù)，但總體來看波前編碼技術(shù)所獲取的景深擴大了約1個數(shù)量級。

Tucker[18]等人在普通生物顯微鏡后部放置三次相位模板，進行了景深的實際測量，實驗結(jié)果如圖3所示。圖3中(a)為傳統(tǒng)顯微鏡獲取的圖像，(b)為插入三次相位板后所獲得的圖像，(c)為經(jīng)過計算重建出來的大景深圖像。圖3(a)中的景深約為9 μm，經(jīng)過拓展后景深約為90 μm，擴展了10倍左右。Pan[30]等人通過研究三次相位板的相位項系數(shù)，發(fā)現(xiàn)景深拓展的理論上限為60倍。Zhao[25]通過優(yōu)化掩膜板，在無限遠系統(tǒng)中插入相位板，在32倍放大率、0.6數(shù)值孔徑角情況下，景深拓展了13倍。

圖3 波前編碼與傳統(tǒng)顯微鏡景深對比Fig.3 Comparison of depth of field between wave front coding and conventional microscope

波前編碼可有效提高顯微鏡的景深范圍至1個數(shù)量級以上，且景深增大的同時保持橫向分辨率不變。但編碼會一定程度的壓縮系統(tǒng)傳遞函數(shù)，因此通過不斷地優(yōu)化模板形式、孔徑方式、插入位置、評價方式等有望進一步提高綜合性能，并朝著實用化角度前進。

3 空間光調(diào)制

在顯微鏡成像光路中插入一些特殊元件，這些元件會按照自身的特性對顯微光場進行一定的空間調(diào)制，在某些模式下系統(tǒng)可得到大景深。例如，在成像光路中插入一圓形或圓環(huán)形孔徑光闌[31-32]，系統(tǒng)會由于通光孔徑的減小而增大景深，但同時也會導(dǎo)致系統(tǒng)傳遞函數(shù)下降，圖像質(zhì)量變差。但是，在系統(tǒng)傳遞函數(shù)還沒有下降到系統(tǒng)最低要求時，可以認(rèn)為這種縮小孔徑是增大景深的一種簡單有效方法。在系統(tǒng)中插入光柵[33]，進行不同深度圖像的CCD分區(qū)域成像，也可增大系統(tǒng)景深。

調(diào)制最為便捷的方法是在成像光路中加入空間光調(diào)制器，通常的做法是在成像光路的傅里葉面上進行調(diào)制，其最大優(yōu)點是靈活，在同樣的硬件配置環(huán)境下，只需進行軟件修改即可實現(xiàn)不同的調(diào)制方式。

實質(zhì)上，空間光調(diào)制器提供了一種光場調(diào)制方式，它可以產(chǎn)生各種需要的模式，比如不同類型的物理孔徑、相位模式。利用空間光調(diào)制器可以制作各種光學(xué)元件，如：各類光闌、衍射透鏡[34]、菲涅爾透鏡[35]、多功能調(diào)制器[36]、光柵[37]等，這些元件的引入使顯微成像產(chǎn)生了很多特性，在一定情況下也提高了顯微鏡的景深。

C. Iemmi[34]在顯微物鏡和CCD中間插入空間光調(diào)制器，然后在調(diào)制器上制作了多種衍射透鏡，在非相干單色光照明情況下，發(fā)現(xiàn)這些透鏡的多路復(fù)用可以產(chǎn)生大的景深圖像，并保持高圖像質(zhì)量。Christian Maurer[35]等人在顯微物鏡后端構(gòu)建一套傅里葉系統(tǒng)，并在傅里葉面上插入一片1 080 pixel分辨率的空間光調(diào)制器，通過在空間光調(diào)制器上制作了多焦距離軸菲涅爾透鏡，并進行了焦距的多路復(fù)用，實現(xiàn)了單次曝光大景深圖像的獲取。

空間光調(diào)制器進行的多路復(fù)用如圖4所示。在顯微物鏡后部插入空間光調(diào)制器，在多路復(fù)用的作用下，焦點前后不同位置處的像分別成像到CCD的不同位置上。因此，通過CCD的一次曝光成像，即可得到不同深度處的圖像。

圖4 SLM原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of spatial light modulation

圖5給出了使用倍率100倍、孔徑角1.3浸油物鏡條件下，系統(tǒng)獲取的不同景深的圖像及這些圖像在空間位置的分布情況。傳統(tǒng)顯微鏡的景深約為0.38 μm，而實驗獲得的有效景深約為8 μm，增大了約20倍。

圖5 SLM縱向顯微圖Fig.5 Axial micrograph of spatial light modulation

空間光調(diào)制技術(shù)盡管提高了景深，但在進行顯微鏡大景深圖像獲取時，犧牲了CCD的橫向分辨率，且當(dāng)引入衍射元件時會產(chǎn)生一定的色散，因而系統(tǒng)更適合于單色光觀察。將空間光調(diào)制器進行照明光調(diào)制時，也可獲取景深增大效果[38]。對于空間光調(diào)制進行顯微景深增大了還需要在系統(tǒng)方式及提高成像質(zhì)量上進一步研究。

4 光場顯微

隨著計算手段的飛速發(fā)展，光學(xué)成像開始更細(xì)致的追求成像過程與更高維度信息場，光場成像就是這樣一種新發(fā)展的光學(xué)技術(shù)。光場是空間中同時包含位置和方向信息參數(shù)化表示[39-40]，理論上來說光場包含了所有的光學(xué)信息，因此通過計算可以得到任何想要得到的光學(xué)信息，實現(xiàn)先拍照后成像。

1996年Levoy的光場渲染理論進一步修改并完善了光場理論[39]，在此基礎(chǔ)上，2005年Ng發(fā)明了第一臺手持式光場相機[41]，2006年Levoy將光場理論運用于顯微成像，并研制出光場顯微鏡[42]，可得到多視角大景深顯微圖像。

Levoy創(chuàng)造的光場顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的差別是在傳統(tǒng)顯微鏡的成像面上插入了一片微透鏡陣列，并在微透鏡陣列的焦面上安裝成像器件，形式如圖6所示。這一改變使得系統(tǒng)記錄的圖像中不僅包含了位置信息，還包含了方向信息，因而記錄的是光場。對此光場圖像進行計算，并重建出顯微圖像，可以得出多維信息。而這一改變卻對顯微鏡景深產(chǎn)生了巨大的影響，表1給出了不同物鏡的景深對比，可以發(fā)現(xiàn)：光場顯微鏡的景深相比傳統(tǒng)顯微鏡提高了約2個數(shù)量級，即使是光場顯微進行了重聚焦后的圖像也比傳統(tǒng)顯微鏡景深提高了約1個數(shù)量級。當(dāng)然，實際系統(tǒng)的景深放大需要考慮微透鏡陣列的焦距、CCD像元的大小等更多綜合因素[43]。但可以發(fā)現(xiàn)，光場顯微鏡在景深上具有極大的優(yōu)勢，圖7給出了光場顯微大景深的實驗效果圖。

圖6 光場顯微原理示意圖Fig.6 Schematic diagram of light field microscopy

表1 不同物鏡的光場顯微景深Table 1 Depths of filed with different objectives inligh field microscopy

圖7 光場顯微大景深圖Fig.7 Depth of field of light field microscopy

光場顯微鏡可以在一次短曝光時間內(nèi)即可獲得大景深動態(tài)現(xiàn)象記錄，這是其他顯微鏡如共聚焦、雙光子等無法比擬的，因此光場顯微鏡適合觀察快速變化、大景深的目標(biāo)。

遺憾的是，光場顯微鏡的大景深是以犧牲橫向分辨率為代價的，而這受制于微透鏡陣列密度和成像CCD分辨率。最近提出的波動光學(xué)模型[44]可以較大程度地提高光場的橫向分辨率，但這依舊是今后的一個努力方向。由于光場顯微并沒有達到衍射極限，光場顯微向縱軸上引入雙透鏡陣列和雙像機[45]、獲取光場圖像的同時獲取常規(guī)圖像[46]或研究更有效果的重建算法[47]方向努力。

隨著高分辨率、低噪聲、高速成像器件、高速計算手段與光場顯微鏡的系統(tǒng)完善，光場顯微鏡會得到更廣泛的發(fā)展。

5 結(jié)論

顯微鏡的大景深成像是隨著生命醫(yī)學(xué)發(fā)展的需要提出的，在當(dāng)今生命科學(xué)迅速發(fā)展情況下，高橫向分辨率的顯微已顯得不夠，更多地需要進行縱向分辨率的顯示，進行三維立體顯示。當(dāng)傳統(tǒng)的顯微技術(shù)遇到此要求時，產(chǎn)生了許多新穎的方法來增大系統(tǒng)的景深，產(chǎn)生了很多具有重大意義的技術(shù)。

本文從生物顯微鏡近年發(fā)展的可大幅擴展景深的技術(shù)出發(fā)，綜合論述了其中的一些技術(shù)，如光學(xué)切片掃描、波前編碼、空間光調(diào)制及光場技術(shù)，對這些技術(shù)的主要處理手段、方式及目前能夠達到的景深拓展水平進行了闡述，并就其技術(shù)的缺陷、研究方向進行了歸納。大景深光學(xué)顯微系統(tǒng)是顯微鏡的發(fā)展趨勢，目前并沒有一個完美的答案，需要涌現(xiàn)更多的具有創(chuàng)新意義的技術(shù)。隨著技術(shù)手段的不斷提高，在不久的將來，我們會擁有景深更大、分辨率更高的顯微鏡。

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