兩種主要鉤蟲分類鑒定的研究進(jìn)展

羅 丹(綜述)，楊亞明(審校)

(1.大理學(xué)院病原與媒介生物研究所普洱分部，云南 普洱 665000； 2.云南省寄生蟲病防治所，云南 普洱 665000 )

鉤蟲是三種主要的土源性線蟲之一。在寄生人體消化道的線蟲中，鉤蟲的危害性最嚴(yán)重，可引起鉤蚴性皮炎、胃腸功能紊亂、營養(yǎng)不良以及長期慢性失血而導(dǎo)致的缺鐵性貧血及與貧血相關(guān)的癥狀。寄生人體的鉤蟲主要為十二指腸鉤口線蟲(Ancylostoma duodenale Dubini，1843)，簡稱十二指腸鉤蟲；美洲板口線蟲(Necatoramericanus Stiles，1902)，簡稱美洲鉤蟲。據(jù)衛(wèi)生部2001～2004年全國人體寄生蟲現(xiàn)狀調(diào)查顯示全國31個省鉤蟲的感染率約為6.12%，推算感染人數(shù)約為3930萬[1]，2006年全球約有7億人為鉤蟲患者[2]，每年由此而損失的傷殘調(diào)整壽命年高達(dá)2210萬人[3]。美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲在分布、致病力以及對驅(qū)蟲藥的敏感性方面均有差異，例如美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲具有不同的地理分布，美洲鉤蟲在熱帶環(huán)境中占主導(dǎo)地位，而十二指腸鉤蟲適應(yīng)干燥寒冷的環(huán)境[4-5]；十二指腸鉤蟲可造成感染者更多的失血[4]；其感染途徑除了可經(jīng)皮膚外，還可經(jīng)口腔黏膜感染[6]。我國使用阿苯達(dá)唑?qū)ν猎葱跃€蟲流行的區(qū)域進(jìn)行大規(guī)模驅(qū)蟲治療的結(jié)果顯示，對十二指腸鉤蟲療效(92%)顯著優(yōu)于美洲鉤蟲(69%～75%)[7-8]。因此，鑒別兩種鉤蟲對流行病學(xué)、生態(tài)學(xué)和防治具有重要意義。

1 運用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行分類鑒定

1.2幼蟲 通稱鉤蚴，常用試管濾紙培養(yǎng)法[10]將患者糞便中含有的鉤蟲蟲卵經(jīng)過3～5 d培養(yǎng)，孵育出幼蟲經(jīng)鏡檢依據(jù)美洲鉤蟲外形：長紡錘形，蟲體較短粗，頭端略圓，尾端較尖；鞘橫紋：顯著；口矛：黑色桿狀，前端稍分叉，兩矛粗細(xì)相等，兩矛間距窄；腸管：管腔較寬，為體寬的3/5，腸細(xì)胞顆粒少。十二指腸鉤蟲外形：圓柱形，蟲體細(xì)長，頭端略扁平，尾端較鈍；鞘橫紋：不顯著；口矛：透明絲狀，背矛較粗，兩矛間距寬；腸管：管腔較窄，為體寬的1/2，腸細(xì)胞顆粒豐富[10]等形態(tài)特征進(jìn)行蟲種的分類鑒別。

1.3蟲卵 診斷鉤蟲感染通常依據(jù)人類糞便樣本中檢出蟲卵[11]，然而美洲鉤蟲卵與十二指腸鉤蟲卵極為相似，僅從形態(tài)學(xué)角度觀察難以區(qū)別[9]。

1.4內(nèi)鏡檢查

1.4.1胃鏡 常規(guī)進(jìn)鏡至十二指腸球部和降部,鏡下可見蟲體長0.5～1.5 cm的鉤蟲,活體呈半透明,灰白色、淡紅色或暗紅色,吸附于腸壁黏膜,呈蛇樣盤曲或蚯蚓樣蠕動,用活檢鉗鉗夾蟲體,蟲體來回擺動,蟲體吸附處黏膜局部充血水腫可見針尖大小新鮮出血灶呈散在點片狀出血，局部少許滲血[12-17]。

1.4.2結(jié)腸鏡 王聲旺等[18]對行胃鏡檢查，已排除上消化道疾病引起出血的可能，并且十二指腸未發(fā)現(xiàn)鉤蟲的12例患者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。其中9例患者首次檢查發(fā)現(xiàn)鉤蟲；3例患者在作結(jié)腸息肉治療時在盲腸、升結(jié)腸部位發(fā)現(xiàn)鉤蟲蟲體。張鳴青等[19]對10例不明原因腹痛、貧血、黑便的患者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，此前均進(jìn)行過胃鏡檢查，排除上消化道疾病引起出血的可能，4例進(jìn)行全消化道X線鋇餐造影，排除小腸疾病，鏡下可見在盲腸處有新鮮出血斑、蟲體形態(tài)以及活動情況。

1.4.3雙氣囊小腸鏡 Kshaunish等[20]報道了3例表現(xiàn)為黑便患者，經(jīng)胃鏡、結(jié)腸鏡檢查未見出血病灶，經(jīng)雙氣囊小腸鏡檢查，其病因是鉤蟲感染。付唆林等[21]對反復(fù)臍周隱痛伴黑便的患者進(jìn)行雙氣囊小腸鏡檢查，進(jìn)鏡至空腸中下段時可見蟲體形態(tài)、活動情況以及黏膜損傷情況。

1.4.4膠囊內(nèi)鏡 陳佳敏等[22]報道，使用膠囊內(nèi)鏡檢查小腸鉤蟲病，發(fā)現(xiàn)膠囊內(nèi)鏡可以清晰顯示蟲體的形態(tài)、寄生小腸內(nèi)的分布、活動和進(jìn)食情況以及腸壁被吸咬后的糜爛創(chuàng)面。常江等[23]報道,膠囊內(nèi)鏡診斷十二指腸鉤蟲致消化道大出血1例，可見空腸上段附著數(shù)條約1 cm長、肉色、半透明的鉤蟲，呈蛇樣盤曲或蚯蚓狀蠕動，局部黏膜明顯充血，伴散在損傷灶并有滲血。Christodoulou等[24]報道了1例原因不明的消化道出血患者，經(jīng)膠囊內(nèi)鏡檢查診斷為小腸鉤蟲病，膠囊內(nèi)鏡能顯示小腸鉤蟲感染和吸血情況，是診斷腸道寄生蟲病的重要的工具。

2 運用免疫學(xué)方法進(jìn)行分類鑒定

2.1免疫沉淀法 Carr等[25]對體外培養(yǎng)的美洲鉤蟲成蟲的排泄-分泌物，應(yīng)用免疫沉淀法進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果顯示，感染該蟲的受染人體血清均可沉淀15×103,13×103,33×103,44×103,46×103和69×103的抗原組分。在免疫印跡實驗中，受感染動物血清至少可識別15個蟲體蛋白質(zhì)組分，其中包括上述的6個主要組分，而33×103的含量不如排泄-分泌物中的豐富;多個受感染者的血清也能識別33×103抗原組分。這些33×103抗原組分不能為感染蛔蟲、鞭蟲的個體血清所識別，十二指腸鉤蟲也無此抗原，表明其具蟲種特異性。

2.2SDS-PAGE法 Pritchard等[26]通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylam idegelelectrophoresis,SDS-PAGE)發(fā)現(xiàn)所有的鉤蟲抗原均含有(14～20)×103的多肽組分，而17×103的抗原組分是美洲鉤蟲所獨有的，具有種特異性。(28～33)×103抗原組分，也能被感染了美洲鉤蟲的患者血清所特異性識別。

2.3ELISA法 在酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中(28～33)×103抗原組分對于鑒別美洲鉤蟲與其他蠕蟲具有極高的敏感性[26]。

2.4SDS-PAGE法和ELIB法 聞禮永等[27]運用SDS-PAGE和酶聯(lián)免疫印漬技術(shù)(enzyme-linked immunoblotting,ELIB)對采集自動物模型的十二指腸鉤蟲第三期幼蟲可溶性抗原蛋白組分(Ad-L3-Ag)和成蟲可溶性抗原蛋白組分(Ad-A-Ag)及免疫反應(yīng)性進(jìn)行了研究。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,十二指腸鉤蟲幼蟲和成蟲蛋白區(qū)帶數(shù)分別為21條和19條。將分帶后的Ad-L3-Ag和Ad-A-Ag進(jìn)行ELIB反應(yīng)表明,十二指腸鉤蟲幼蟲和成蟲特異性抗原組分分別為(40～41)×103和(54～56)×103。

3 運用分子生物學(xué)方法

3.1DNA序列測定 李鐵華等[28]根據(jù)后生無脊椎動物CO1基因保守區(qū)域序列,合成上、下游引物，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增采集自四川省合江縣的鉤蟲成蟲的CO1基因，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，結(jié)果顯示十二指腸鉤蟲與美洲鉤蟲CO1基因序列同源性達(dá)89.7%，存在10.3%的特定核苷酸差異，并證明該核苷酸序列的差異是穩(wěn)定的，可作為兩種鉤蟲鑒定的標(biāo)志。

3.2分子標(biāo)記 鄭琪等[29]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中美洲鉤蟲CO1基因和十二指腸鉤蟲CO1基因的序列分別設(shè)計出美洲鉤蟲種鑒別正反兩條PCR擴(kuò)增引物NaF-NaR，十二指腸鉤蟲種鑒別正反兩條PCR擴(kuò)增引物AdF-AdR，對采集自福建、貴州、四川、海南和廣西五省鉤蟲成蟲的CO1基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示以五省的美洲鉤蟲DNA為模板的PCR擴(kuò)增均可獲得一條長約500 bp的條帶，以五省的十二指腸鉤蟲DNA為模板的PCR擴(kuò)增均可獲得一條長約700 bp的條帶，特異性檢驗顯示兩對引物具有較好的特異性，構(gòu)建特定的引物作為分類鑒定兩種鉤蟲的分子標(biāo)志物是可行的。

3.3實時熒光PCR 汪家旭等[30]和Wang等[31]將采集自福建省廈門市海滄區(qū)農(nóng)村的人糞便標(biāo)本在27 ℃恒溫條件下孵化，收集鉤蚴，在根據(jù)GenBank中美洲鉤蟲的ITS-2序列設(shè)計特異性引物,提取幼蟲蟲體基因組DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS-2序列、克隆、測序和比對，實驗獲得的美洲鉤蟲rDNA ITS序列經(jīng)對比與數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致；利用常規(guī)PCR依次以美洲鉤蟲、糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)、犬鉤蟲(Ancylostoma caninum) DNA和水為模板檢驗引物的特異性，結(jié)果顯示無PCR產(chǎn)物產(chǎn)生證明引物的特異性良好；將ITS-2序列擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化后經(jīng)T克隆轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5a,提取重組質(zhì)粒,鑒定后作為標(biāo)準(zhǔn)模板建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并做靈敏度和重復(fù)性實驗，結(jié)果顯示各溶解曲線為單一吸收峰,產(chǎn)物專一；實時熒光PCR特異性實驗結(jié)果美洲鉤蟲檢出了明顯的擴(kuò)增曲線,而其余模版未檢出熒光曲線,表明所設(shè)計的美洲鉤蟲實時熒光PCR檢測引物能特異性檢測出美洲鉤蟲DNA；實時熒光PCR可以檢測200 mg糞便中僅含有1個蟲卵，靈敏度比常規(guī)PCR至少可高100倍；變異系數(shù)<3%,表明熒光PCR檢測方法具有較高的可重復(fù)性；為美洲鉤蟲的鑒別以及快速、靈敏、定量檢測提供了技術(shù)支撐。

4 三種分類方法的優(yōu)缺點評述

以上綜述的方法中運用形態(tài)學(xué)方法對兩種鉤蟲進(jìn)行分類，所需儀器設(shè)備及操作方法相對比較簡單，但這種方法可靠性不強(qiáng)，而且要求檢查者具有豐富的經(jīng)驗并且熟練掌握兩種鉤蟲成蟲及幼蟲的體態(tài)特征[32]，對待檢樣本也有較高要求，對于輕度感染患者，驅(qū)蟲后獲取的蟲體較少或蟲體破損等均會影響檢查者的判斷；培養(yǎng)幼蟲則需要耗費時間；而對于蟲卵僅從形態(tài)學(xué)不能進(jìn)行蟲種鑒定。而運用免疫學(xué)方法，由于其抗原特異性欠佳,作為蟲種鑒定的可行性沒有確切的文獻(xiàn)證實，沒有得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)階段分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用到寄生蟲學(xué)與寄生蟲病研究領(lǐng)域，其中PCR技術(shù)因其操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和信息量豐富等優(yōu)點[33]，彌補了形態(tài)學(xué)分類上的不足和難以鑒別而得到了廣泛應(yīng)用。運用分子生物學(xué)方法可以用于鑒別從形態(tài)學(xué)無法確定的殘損蟲體及不典型的鉤蟲成蟲，同時也避免了免疫學(xué)方法易發(fā)生交叉反應(yīng)的情況，僅用小部分成蟲蟲體即可成功制備DNA并擴(kuò)增出目的條帶用于鑒定美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲且準(zhǔn)確性較高；但此方法對儀器設(shè)備有一定的要求，并且現(xiàn)有文獻(xiàn)僅證實用此方法可對兩種鉤蟲的成蟲和鉤蚴進(jìn)行分類鑒定，而對于蟲卵是否有效還有待于進(jìn)一步探討證明。

5 結(jié) 語

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展許多傳統(tǒng)方法由于自身缺陷無法滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的需要，促使人們尋找新的、快速準(zhǔn)確的工具進(jìn)行診斷和防治，而鑒定蟲種可以評估驅(qū)蟲藥物對兩種鉤蟲相應(yīng)的療效，可以了解不同地區(qū)的優(yōu)勢鉤蟲蟲種，再選擇合適的驅(qū)蟲藥物從而取得更好的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)效益[34]。此外，鉤蟲蟲種的鑒定可以對監(jiān)控鉤蟲的流行狀況也非常重要，能夠提供疾控部門兩種鉤蟲在干預(yù)措施下的流行病學(xué)資料，評估疾病干預(yù)的效果等，對于鉤蟲病的研究具有重大意義。

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