大腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的間質(zhì)差異表達(dá)基因的篩選

程家樂，姚 敬，彭佳遠(yuǎn)，汪 昱

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科,上海200000)

大腸癌是影響人類健康的重要疾病，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)位于第三位。盡管診斷技術(shù)和治療方式的不斷改進(jìn)，每年仍有約100萬人發(fā)生大腸癌，并且有60萬人死于該病[1]，約一半大腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中通過門靜脈系統(tǒng)肝轉(zhuǎn)移是主要的轉(zhuǎn)移途徑[2-3]。故對大腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及早期診斷成為治療的關(guān)鍵。大腸癌肝轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞相關(guān)基因目前國內(nèi)外研究較多，而間質(zhì)遺傳不穩(wěn)定基因國外報道較少，國內(nèi)未見報道。激光捕獲顯微切割和基因芯片兩種新興技術(shù)已成為腫瘤研究的重要手段。前者能在顯微鏡直視下通過激光捕獲和顯微切割從異質(zhì)性組織中得到目的細(xì)胞或細(xì)胞群，保證了組織的同質(zhì)性；后者可同時高效率檢測成千上萬個基因，是篩選差異表達(dá)基因有力的工具。因此，本實驗聯(lián)合應(yīng)用激光捕獲顯微切割和基因芯片技術(shù)篩選大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)相關(guān)基因，為臨床早期診斷和靶向治療大腸癌肝轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 于2008年7月至2010年7月由上海市第六人民醫(yī)院提供的手術(shù)切除大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移及不伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶標(biāo)本各4例。大腸癌非轉(zhuǎn)移為大腸癌術(shù)后2年內(nèi)未見肝轉(zhuǎn)移的病例。實驗標(biāo)本基本信息見表1，所有患者術(shù)前均未行化療和放療，術(shù)后30 min內(nèi)取腫瘤組織并與液氮罐保存?zhèn)溆?，全部?biāo)本均由病理學(xué)診斷確診。

表1 大腸癌標(biāo)本臨床病理資料

mT代表有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶組織;T代表無肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織;1～4為標(biāo)本序號

1.2激光捕獲顯微切割與微量RNA提取 標(biāo)本取出后，用冰凍切片機(德國徠卡儀器公司生產(chǎn),型號:CM1850 UV)行連續(xù)切片，厚度約7 μm，將切片放在56 ℃烘烤過夜，HE染色，室溫待標(biāo)本干燥后采用激光顯微切割機(Arctururs公司生產(chǎn),型號:Pix Cell Ⅱ LCM)切割，分離出標(biāo)本中的間質(zhì)組織。顯微切割時間不能超過30 min，以免RNA降解。使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號:15596026)進(jìn)行標(biāo)本微量RNA提取。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司生產(chǎn),型號:74104)純化RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度。根據(jù)檢測結(jié)果，質(zhì)量合格的RNA進(jìn)入下一步實驗。

1.3RNA線性擴增、熒光標(biāo)記和芯片雜交 質(zhì)檢合格的RNA樣本，采用單標(biāo)快速擴增熒光標(biāo)記試劑盒(安捷倫公司生產(chǎn),批號:0006081570)進(jìn)行互補核糖核酸(complementary ribonucleic acid,cRNA)合成，行線性擴增，Cy3單色熒光標(biāo)記，用紫外分光光度計(安捷倫公司生產(chǎn)，型號:ND-1000)檢測標(biāo)記后的cRNA質(zhì)量和熒光標(biāo)記率，當(dāng)RNA溶液的A260/A280比值范圍在1.8～2.1之間時，說明RNA純度好。檢測合格的標(biāo)志物與安捷倫人全基因組表達(dá)譜芯片(4×44K 2.0)雜交，洗滌。

1.4芯片檢測資料的分析 采用安捷倫微陣列掃描儀(安捷倫公司生產(chǎn),型號:G2505B)掃描芯片，將安捷倫芯片特征提取軟件讀出的熒光值導(dǎo)入Agilent Genespring GX軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后得出大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)標(biāo)記的信號比值(倍數(shù)變化)，即為該基因組在大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)中變化情況。最后經(jīng)過T-test檢驗，篩選出倍數(shù)變化≥2的基因為表達(dá)顯著上調(diào)基因，倍數(shù)變化≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。同時將所有差異性表達(dá)基因?qū)階gilent Genespring GX軟件后，得出基因本體學(xué)分析和通路分析結(jié)果。

1.5實時定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證4個基因的表達(dá) 利用激光捕獲顯微切割提取4例大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶及4例大腸癌不伴肝轉(zhuǎn)移癌灶的間質(zhì)組織，使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號:15596026)進(jìn)行標(biāo)本微量RNA提取。對表達(dá)上調(diào)骨膜蛋白(Periostin)基因、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)基因和表達(dá)下調(diào)的過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator,PGC)、趨化因子配體21(chemokine ligand 21,CCL21)基因進(jìn)行驗證。

2 結(jié) 果

2.1激光捕獲顯微切割后的組織 激光捕獲顯微切割后，間質(zhì)成功地從組織中分離出來。如圖所示,圖1-1(見封三)為其中1例伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)切割后的剩余組織;圖1-2(見封三)為該例伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌切割下來的間質(zhì);圖1-3(見封三)為其中1例不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)切割后的剩余組織;圖1-4(見封三)為該例不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌切割下來的間質(zhì)。

2.2甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量 由于通過激光捕獲顯微切割獲得的目的細(xì)胞數(shù)量有限，RNA產(chǎn)量較低，故點樣量相對偏少RNA變性瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)28S和18S兩條帶，且28S帶密度約為18S帶密度的2倍，幾乎未出現(xiàn)其他混雜帶(圖2)，據(jù)此可判斷RNA質(zhì)量好，可以進(jìn)入下一步的實驗。

mT:伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶間質(zhì)細(xì)胞;T：不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織的間質(zhì)細(xì)胞;1～4：標(biāo)本編號

圖2微量RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳

2.3熒光標(biāo)記的cRNA定量分析 激光捕獲顯微切割所得的總RNA經(jīng)過線性擴增，紫外分光光度計檢測表明所得的cRNA量為1.70～1.86 μg，大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)組織的A260/A280比值介于1.9～2.1之間，說明RNA純度高，熒光標(biāo)記效率在9 pmol/μg以上可參加雜交反應(yīng)，RNA基本信息見表2。質(zhì)量合格，可進(jìn)入下一步實驗。

表2 大腸癌RNA樣品基本信息

mT:伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶間質(zhì)細(xì)胞；T：不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織的間質(zhì)細(xì)胞

2.4芯片檢測結(jié)果 用Cy3分別標(biāo)記大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)，與芯片雜交后掃描圖像，可以看到空白對照點無信號，陰性對照點有弱信號，陽性對照點為強信號。經(jīng)Agilent Genespring GX軟件分析，背景信號噪音低，證實該實驗可靠。用大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)的熒光信號作散點圖，大部分聚集在一個以45°對角線為中心的區(qū)域里，表示信號差異在0.5～2.0之間，所有差異性基因均滿足P<0.05(圖3)。

圖3-1 mT1 VS T1 圖3-2 mT2 VS T2

圖3-3 mT3 VS T3 圖3-4 mT4 VS T4

圖3大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因的散點圖其中位于三條基線之間的為表達(dá)無顯著差異的基因，位于最上層基線之上的為上調(diào)基因，位于最下層基線之下的為下調(diào)基因

2.5生物學(xué)信息分析 依熒光素大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)/不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)比值(倍數(shù)變化)>2.0或<0.5的數(shù)據(jù)項差異表達(dá)，共篩選出1948條基因發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)的有1266條，下調(diào)的有682條，將這些基因按基因本體論分析分子功能進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因與細(xì)胞分化、酶活性調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)等有關(guān)。按通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、局部黏附、細(xì)胞黏附分子、抗原過程和呈遞、細(xì)胞因子間相互作用、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等通路。

2.6實時定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證結(jié)果 基因Periostin、IGF-2在肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中均高表達(dá)，基因PGC、CCL21在肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中均低表達(dá)。表3顯示各基因的引物和產(chǎn)物。上述結(jié)果與基因芯片的表達(dá)結(jié)果是一致的(表4)，說明基因芯片結(jié)果可靠。

表3 引物列表

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Periostin：骨膜蛋白； IGF-2：胰島素樣生長因子2； PGC：過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子；CCL21：趨化因子配體21

表4 樣品的待測基因相對含量表

mT:有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)組織；T：無肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)組織；mT/T代表基因的相對比值 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Periostin：骨膜蛋白;IGF2：胰島素樣生長因子;PGC：過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子;CCL21：趨化因子配體21

3 討 論

人類的大部分惡性腫瘤都起源于上皮細(xì)胞，在正常情況下，起源于上皮細(xì)胞層的惡性腫瘤與起支持作用的間質(zhì)細(xì)胞被基底膜分隔。長期以來學(xué)者們都認(rèn)為上皮細(xì)胞惡性腫瘤只與上皮細(xì)胞相關(guān)，其治療方案也只針對上皮細(xì)胞本身。然而惡性腫瘤的進(jìn)展不僅有上皮細(xì)胞的癌癥相關(guān)變化，作為腫瘤生長微環(huán)境的間質(zhì)細(xì)胞在上皮細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展中也起了重要的作用[4]。目前上皮與間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中的相互作用主要有兩種學(xué)說：一種是間質(zhì)細(xì)胞首先發(fā)生異常進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞的變異，另一種是變異的上皮細(xì)胞通過旁分泌的方式引起間質(zhì)的腫瘤相關(guān)變化[5]。間質(zhì)中存在著多種細(xì)胞：由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周皮細(xì)胞組成的脈管系統(tǒng)為組織輸送氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)[6]，由趨化因子及細(xì)胞因子募集的炎性細(xì)胞及免疫細(xì)胞同時有致癌和抑癌作用[7]，在腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程中，間質(zhì)中處于靜息狀態(tài)的纖維母細(xì)胞變?yōu)榛罨睦w維母細(xì)胞，是上皮與間質(zhì)旁分泌信號通路的主要調(diào)控者[8]。

本研究結(jié)合激光捕獲纖維切割和基因芯片兩種技術(shù)篩選出了與大腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的腸癌間質(zhì)基因共1948條，分別為1266條上調(diào)基因及682條下調(diào)基因。這些基因與細(xì)胞分化、酶活性調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子間相互作用等相關(guān)。并通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證基因芯片結(jié)果，證實基因芯片結(jié)果可靠。

研究表明，在乳腺癌[9]、前列腺癌[10]、Wilms瘤[11]中 IGF-2雙等位基因不僅在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，與腫瘤鄰接的組織中也有一定程度的表達(dá)，這些研究提示在腫瘤的進(jìn)展過程中，IGF-2基因不僅于上皮細(xì)胞中高表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞可能也會出現(xiàn)高表達(dá)。關(guān)華鶴[12]研究表明大腸癌組織和癌旁正常組織均出現(xiàn)IGF-2高表達(dá)，且大腸癌中IGF-2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這表明IGF-2與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究顯示伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中IGF-2表達(dá)顯著高于不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)，提示IGF-2于間質(zhì)中高表達(dá)是大腸癌肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素，其機制還有待進(jìn)一步研究。

Bao等[13]研究發(fā)現(xiàn)Periostin基因在80%的原發(fā)結(jié)腸癌組織中表達(dá)，并在所有肝轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)，且肝轉(zhuǎn)移灶中Periostin基因的表達(dá)遠(yuǎn)高于原發(fā)結(jié)腸癌組織，這表明Periostin基因高表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。Kikuchi等[14]通過免疫組化和電鏡證實Periostin由結(jié)腸腺周間質(zhì)和結(jié)腸癌相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞分泌。這些研究提示間質(zhì)中Periostin基因高表達(dá)與大腸癌肝轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，本實驗結(jié)果應(yīng)證了這一點，也進(jìn)一步說明Periostin確實是在間質(zhì)中表達(dá)的基因。

Liang等[15]將PGC-1α基因?qū)胄∈箝g質(zhì)細(xì)胞，使該基因于間質(zhì)高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入PGC-1α基因后間質(zhì)線粒體形成與清除氧自由基的作用增強，這提示PGC-1基因于間質(zhì)中的表達(dá)情況也影響著腫瘤的預(yù)后，且PGC-1基因表達(dá)下降的致癌作用可能與其降低細(xì)胞能量代謝有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)PGC-1的低表達(dá)存在于人結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌組織中[16-18]。然而，間質(zhì)中PGC-1基因的表達(dá)情況與大腸癌肝轉(zhuǎn)移目前未見報道。本研究結(jié)果提示PGC-1在大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)中低表達(dá)，表明PGC-1在大腸癌發(fā)生，發(fā)展中可能有抑癌作用，還需進(jìn)一步研究。

Yousefieh等[19]發(fā)現(xiàn)，使小鼠前列腺癌間質(zhì)高表達(dá)CCL21基因，利用CCL21的趨化功能，使樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集于腫瘤間質(zhì)可以抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其中樹突狀細(xì)胞作用于記憶性T細(xì)胞和初始T細(xì)胞，使其變?yōu)榫哂行?yīng)的T細(xì)胞，可以直接殺死腫瘤細(xì)胞。Mumtaz等[20]于2008的研究顯示，大腸癌患者體內(nèi)的CCL21較正常人呈明顯的低水平表達(dá)狀態(tài)?？梢酝茢啵竽c癌間質(zhì)中CCL21基因的表達(dá)必然和肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，本實驗利用基因芯片篩選到的大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因中CCL21與不伴肝轉(zhuǎn)移腸癌間質(zhì)相比低水平表達(dá)，提示CCL21有望成為大腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷及免疫治療的分子標(biāo)志物。

本研究聯(lián)合應(yīng)用激光顯微切割與基因芯片技術(shù)成功構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因，并用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)驗證了基因芯片的準(zhǔn)確性。以上多個差異表達(dá)基因，在以往大腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生機制研究中報道較少，其在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的明顯高表達(dá)或低表達(dá)，說明它們在大腸癌肝轉(zhuǎn)移癌變過程中可能起了較大作用，至于其具體作用機制尚需進(jìn)一步研究。下一步研究將從基因組、蛋白質(zhì)組水平上對重點基因進(jìn)行大樣本檢測，以確定大腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子機制、診斷和治療靶點。

[1] Chaffer CL,Weinberg RA.A perspective on cancer cell metastasis[J].Science,2011,331(6024):1559-1564.

[2] Gumbiner BM.Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis[J].Nat Rev Mol Cell Bio,2005,6(8):622-634.

[3] Su J,You P,Li WL,etal.The existence of multipotent stem cells with epithelial-mesenchymal transition features in the human liver bud[J].Int J Biochem Cell B,2010,42(12):2047-2055.

[4] Bissell MJ,Radisky D.Putting tumours in context[J].Nat Rev Cancer,2001,1(1):46-54.

[5] Polyak K,Haviv I,Campbell IG.Co-evolution of tumor cells and their microenvironment[J].Trends Genet,2009,25(1):30-38.

[6] Lohela M,Bry M,Tammela T,etal.VEGFs and receptors involved in angiogenesis versus lymphangiogenesis[J].Curr Opin Cell Biol,2009,21(2):154-165.

[7] Muller-Hubenthal B,Azemar M,Lorenzen D,etal.Tumour biology:tumour-associated inflammation versus antitumor immunity[J].Anticancer Res,2009,29(11):4795-4805.

[8] Lorusso G,Ruegg C.The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis[J].Histochem Cell Biol,2008,130(6):1091-1103.

[9] Douc-Rasy S,Barrois M,Fogel S,etal.High incidence of loss of heterozygosity and abnormal imprinting of H19 and IGF2 genes in invasive cervical carcinomas.Uncoupling of H19 and IGF2 expression and biallelic hypomethylation of H19[J].Oncogene,1996,12(2):423-430.

[10] Jarrard DF,Bussemakers MJ,Bova GS,etal.Regional loss of imprinting of the insulin-like growth factor II gene occurs in human prostate tissues[J].Clin Cancer Res,1996,1(12):1471-1478.

[11] Okamoto K,Morison IM,Taniguchi T,etal.Epigenetic changes at the insulin-like growth factor II/H19 locus in developing kidney is an early event in Wilms tumorigenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(10):5367-5371.

[12] 關(guān)華鶴.大腸癌中IGF2印記丟失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系[D].沈陽:中國醫(yī)科大學(xué),2009.

[13] Bao S,Ouyang G,Bai X,etal.Periostin potently promotes metastatic growth of colon cancer by augmenting cell survival via the Akt/PKB pathway[J].Cancer Cell,2004,5(4):329-339.

[14] Kikuchi Y,Kashima TG,Nishiyama T,etal.Periostin is expressed in pericryptal fibroblasts and cancer—associated fibroblasts in the colon[J].J Histochem Cytochem,2008,56(8):753-764.

[15] Liang H,Bai Y,Li Y,etal.PGC-1α-Induced Mitochondrial Alterations in 3T3 Fibroblast Cells[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1100:264-279.

[16] Jiang WG,Douglas-Jones A,Mansel RE.Expression of peroxisome-proliferator activated receptor-gamma(PPARγ)and the PPARγ co-activator,PGC-l，in human breast cancer correlates with clinical outcomes[J].Int J Cancer,2003,106(5):752-757.

[17] Feilchenfeldt J,Bnundler MA,Soravia C,etal.Peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs) and associated transcription factors in colon Cancer:Reduced expression of PPARγ-coactivator l(PCG-1)[J].Cancer Lett,2004,203(1):25-33.

[18] Jiang WG,Davies G,Kynaston H，etal.Does the PGC-1/PPARγ pathway play a role in Com-1/p8 mediated cell growth inhibition in prostate cancer?[J].Int J Mol Med,2006,18(6):1169-1175.

[19] Yousefieh N,Hahto SM,Stephens AL,etal.Regulated expression of ccl21 in the prostate tumor microenvironment inhibits tumor growth and metastasis in an orthotopic model of prostate cancer[J].Cancer Microenvironment,2009,2(1):59-67.

[20] Mumtaz M,Wfigsiiter D,LofgrenS,etal.Decreased expression of the chemokine CCL21in humancolorectal adenocarcinomas[J].Oncol Rep,2009，21(1):153-158.