異丙酚麻醉對大鼠海馬各區(qū)c-fos、c-jun 基因及蛋白表達的影響

楊 軍，沈 磊

(長江航運總醫(yī)院 武漢腦科醫(yī)院麻醉科，武漢 430010)

近些年異丙酚已在各類型臨床手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用，其靜脈全身麻醉在機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制仍未完全明確[1-2]。c-fos和c-jun是即早基因中的兩大重要基因族，兩者共同參與腦神經(jīng)元的可塑性變化，而這種可塑性在長期記憶形成過程中占有相當(dāng)重要的地位。有研究報道認為，其在麻醉作用機制中也起著關(guān)鍵性作用[3-4]。本研究擬觀察不同濃度異丙酚靜脈全身麻醉對大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun基因及蛋白表達的影響，進而了解異丙酚靜脈全身麻醉的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只Wistar大鼠購自華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，清潔級，均為2月齡，體質(zhì)量平均為(150±20) g，雌雄不限。

1.2主要實驗試劑 異丙酚購自天津澤森化工有限公司，兔抗大鼠c-fos，c-jun多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、三磷酸脫氧核苷為Sigma產(chǎn)品，DNA聚合酶為ABI產(chǎn)品，c-fos、c-jun及β-actin引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3實驗方法 40只實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，對照組(A組，n=10)：腹腔注射相同劑量生理鹽水溶液(50 mL/kg)；小劑量異丙酚組(B組，n=10)：腹腔注射50 mg/kg異丙酚(意大利Astrazenea公司，批號CR766)；中等劑量異丙酚組(C組，n=10)：腹腔注射100 mg/kg異丙酚；大劑量異丙酚組(D組，n=10)：腹腔注射150 mg/kg異丙酚。各組大鼠麻醉1 h后解剖海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)等腦組織。

1.4RT-PCR方法

1.4.1總RNA提取與鑒定 根據(jù)RT-PCR試劑盒操作步驟提取各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)腦組織總RNA，然后檢測260/280 nm處的吸光度值。

1.4.2RTPCR兩步法 cDNA合成方法：總2 μg RNA加入1 μL oligo(dT)，5 μL 5×轉(zhuǎn)錄酶(AMV) buffer，2.5μL dNTP(10 mmol/L)，l μL AMV-RT(10 U/μL)，l μL 核糖核酸抑制劑(40 U/μL)，焦磷酸二乙酯處理水補充至總體積為25 μL，完全混勻后在42 ℃溫度條件下水浴處理60 min。PCR引物的序列和長度見表1。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物(由上海生物工程技術(shù)有限公司合成)

1.5蛋白印跡(Western blot)方法 稱取各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)腦組織總蛋白40 μg，在94 ℃溫度條件下加熱處理10 min，然后使用分離膠對組織樣品予以SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，然后從凝膠組織中將蛋白質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至濾膜，電泳轉(zhuǎn)印處理后行Western blot檢測，一抗以1∶200予以稀釋處理，二抗則以1∶750予以稀釋處理，最后采用二氨基聯(lián)苯胺試劑盒顯色處理，如有蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)立即用大量磷酸鹽緩沖液溶液沖洗以終止Western blot反應(yīng)過程，實驗結(jié)果采用專用掃描儀器分析和處理，其中c-fos、c-jun的相對分子質(zhì)量分別為55×103和39×103。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠海馬各區(qū)c-fos mRNA、c-jun mRNA表達水平 大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun基因表達水平隨著異丙酚麻醉藥物作用濃度的增加而顯著升高(P<0.05)；海馬CA3區(qū)未發(fā)現(xiàn)異丙酚對c-fos、c-jun基因表達水平的影響(表2)。

2.2各組大鼠海馬各區(qū)c-fos、c-jun蛋白表達水平 大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun蛋白的表達水平隨著異丙酚麻醉藥物作用濃度的增加顯著性升高(P<0.05)；海馬CA3區(qū)未發(fā)現(xiàn)異丙酚對c-fos、c-jun蛋白表達水平的影響(表3)。

表2 各組大鼠海馬各區(qū)c-fos mRNA、c-jun mRNA表達水平

表3 各組大鼠海馬各區(qū)c-fos、c-jun蛋白表達水平

3 討 論

國內(nèi)外較多研究報道認為，異丙酚靜脈全身麻醉作用機制與受體-離子通道復(fù)合物之間存在著密切的聯(lián)系[5]，但上述研究僅限于離子型受體方面，其作用效應(yīng)持續(xù)時間相對較短。而海馬是機體腦組織邊緣系統(tǒng)的重要部分，在情緒變化、感覺活動和學(xué)習(xí)記憶等方面起著相當(dāng)重要的作用，與靜脈全身麻醉的作用機制有著密切的相關(guān)性[6-7]。因此，本研究觀察了c-fos、c-jun在異丙酚靜脈全身麻醉大鼠海馬各區(qū)域內(nèi)的表達水平。

即早基因是可被第二信使誘導(dǎo)的原癌基因，可對各種類型的刺激因素做出相應(yīng)反應(yīng)并予以一定表達，在機體內(nèi)充當(dāng)核內(nèi)第三信使的生理學(xué)作用，與學(xué)習(xí)記憶等功能的調(diào)控作用存在十分緊密的聯(lián)系。而即早基因的兩大基因族——c-fos、c-jun可有效偶聯(lián)刺激和神經(jīng)元內(nèi)的基因表達，在腦神經(jīng)元受到各類型刺激作用后可迅速表達和編碼c-fos、c-jun蛋白[8-9]。由于兩者可形成同源或異源二聚體活化蛋白轉(zhuǎn)錄因子1，進而改變其與神經(jīng)元遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合的特異性，增加活化蛋白轉(zhuǎn)錄因子1的生物學(xué)活性作用，參與各效應(yīng)作用酶蛋白分子的信號轉(zhuǎn)錄過程，進而調(diào)控基因表達和靶蛋白合成等過程[10]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)c-fos、c-jun基因和蛋白的表達水平隨著異丙酚麻醉藥物作用濃度的增加而顯著升高(P<0.05)，提示異丙酚對大鼠海馬神經(jīng)元的突觸適應(yīng)性和可塑性均有一定程度的影響作用[8-9]。異丙酚可能通過影響c-fos、c-jun基因和蛋白的表達水平而發(fā)揮抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理學(xué)作用。而本研究還發(fā)現(xiàn)，在CA3區(qū)未發(fā)現(xiàn)異丙酚對c-fos、c-jun基因和蛋白表達水平的影響作用，提示異丙酚麻醉抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用部位存在明顯的差異性，CA3區(qū)可能并不是異丙酚麻醉的作用位點。

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