pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

盧 豪,龐 偉,徐 婷,楊紅澎,奚用勇,黃承鈺,蔣與剛

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是腦內(nèi)含量最為豐富的蛋白之一,約占腦內(nèi)可溶性蛋白的2%。它作為一種去泛素化酶,參與泛素的再循環(huán),調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)的蛋白降解功能[1-2]。它最初是作為一種神經(jīng)元特異性蛋白被發(fā)現(xiàn)的,被命名為蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)。UCH-L1的作用主要表現(xiàn)在三個(gè)方面：(1)泛素水解酶活性:單體形式下,UCH-L1催化泛素C末端酯基和氨基的水解,通過(guò)這種途徑,UCH -L1能循環(huán)使用泛素分子,這對(duì)于細(xì)胞中蛋白的降解至關(guān)重要[3]。(2)泛素連接酶活性:二聚體形式下,UCH-L1的連接酶活性以α泛素核蛋白作為底物,以賴(lài)氨酸63為連接點(diǎn)形成泛素鏈,這使得底物免受蛋白酶體系統(tǒng)的降解,從而維持底物的穩(wěn)定性[4]。(3)單體穩(wěn)定效應(yīng):大量泛素單體與UCH-L1緊密連接,可阻止泛素單體在腦中的降解[5]。 在前期研究中,我們通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺鋅可引起大鼠海馬UCH-L1表達(dá)下調(diào)、電壓門(mén)控陰離子通道-1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)表達(dá)上調(diào),并通過(guò)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證[6-7]。因此推測(cè),缺鋅引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷可能與UCH-L1水平降低[8]、VDAC1水平上升相關(guān)聯(lián)。為了深入研究UCH-L1在缺鋅致認(rèn)知功能損傷中的作用機(jī)制,我們首先選用pEGFP-N1質(zhì)粒構(gòu)建UCH-L1基因重組表達(dá)載體,取得陽(yáng)性克隆,命名為pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)探討UCH-L1在神經(jīng)退行性疾病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為VDAC1的深入研究進(jìn)行技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生第1～3 d的Wistar乳鼠,由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK(津)2009-0001]。Trizol 試劑、瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen 公司；TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)、DNA Ligation Kit Ver.2.0、DNA Ligation Kit、BglⅡ限制酶和SalⅠ限制酶均購(gòu)自大連TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TIANgel Midi Purification Kit購(gòu)自北京天根公司；EZgeneTMEndoFree ezFlow Plasmid Miniprep Kit購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司；pEGFP-N1質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所全軍軍事應(yīng)激醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉曉華教授饋贈(zèng)。

1.2引物設(shè)計(jì) 根據(jù)UCH-L1基因(GenBank NM_017237)信息添加酶切位點(diǎn)(BglⅡ,SalⅠ),設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,上游引物序列：5' GCCAGATCTATGCAGCTGAAACCGATGG 3'；下游引物序列：5' ACGCGTCGACGCGGCTGCTTTGCAGAGAGC 3'。引物由大連寶生物公司合成。

1.3UCH-L1基因的擴(kuò)增 用Trizol試劑提取Wistar乳鼠腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增UCH-L1基因。反應(yīng)體系為：10×one step RNA PCR Buffer 5 μl,MgCl2(25 mM) 10 μl,dNTP混合物(各10 mM)5 μl,RNase抑制劑(40 U/μl)1 μl,AMV RTase XL(5 U/μl)1 μl,AMV-Optimized Taq(5 U/μl)1 μl,上游引物(20 μM)1 μl,下游引物(20 μM)1 μl,上樣量1 μl,補(bǔ)足RNase Free dH2O至50 μl。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.4pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 回收純化基因擴(kuò)增產(chǎn)物,與pEGFP-N1載體分別經(jīng)Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ酶切,再回收純化UCH-L1基因及pEGFP-N1載體片段,經(jīng)T載體16 ℃反應(yīng)30 min,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含50 μg/ml卡那霉素的LB平板,于37 ℃培養(yǎng) 12～16 h,挑取單一的菌落擴(kuò)增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒由北京華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1UCH-L1基因的擴(kuò)增結(jié)果 提取的RNA通過(guò)RT-PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳分離,如圖1所示獲得了預(yù)期的約700 bp片段,并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收 DNA片段。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增UCH-L1基因

2.2質(zhì)粒和目的DNA 基因片段的雙酶切結(jié)果 將目的DNA基因片段和pEGFP-N1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切,電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。從凝膠回收目的片段,然后進(jìn)行連接反應(yīng),轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,鋪板,于37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單一的菌落擴(kuò)增培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

圖2 pEGFP-N1質(zhì)粒和UCH-L1基因片段雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖

2.3質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果 圖3為質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果,通過(guò)Blast搜索,證明就是我們所克隆的UCH-L1基因。結(jié)果表明,已成功構(gòu)建了pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒。

圖3 pEGFP-N1-UCH-L1質(zhì)粒序列圖

3 討論

UCH-L1屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)中的泛素羧基端水解酶家族,分布于腦、睪丸、卵巢、腎臟、腫瘤等組織,經(jīng)由泛素相關(guān)途徑行使對(duì)細(xì)胞分化、增生和凋亡的調(diào)節(jié)功能。UCH-L1在大腦中的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于睪丸、卵巢、腎臟等組織,與腦功能密切相關(guān)。UCH-L1在神經(jīng)元內(nèi)廣泛表達(dá),已觀察到海馬神經(jīng)元胞體和樹(shù)突內(nèi)均有分布,以維持海馬神經(jīng)元的正常突觸結(jié)構(gòu)和功能[9-10]。而且研究發(fā)現(xiàn),UCH-L1對(duì)于維持正常的突觸功能和學(xué)習(xí)記憶能力是必需的,恢復(fù)UCH-L1水平,可逆轉(zhuǎn)β淀粉樣蛋白處理的海馬腦片和阿爾茨海默病模型小鼠海馬腦片的突觸傳遞功能障礙,并且給予外源性UCH-L1可改善模型小鼠的認(rèn)知功能[11-12]。在胚胎的發(fā)育中,UCH-L1已經(jīng)分布于未分化的中樞神經(jīng)和周?chē)窠?jīng)。研究表明,UCH-L1通過(guò)與單體泛素的相互作用,來(lái)調(diào)控神經(jīng)元前體細(xì)胞的形態(tài)和分化,從而證明了UCH-L1在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要地位[13]。在成熟神經(jīng)元中,UCH-L1仍然有很高的表達(dá)。

作為UPS中一種重要的酶,UCH-L1在阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生及發(fā)展中的重要作用日益受到關(guān)注,但眾多的環(huán)節(jié)與機(jī)制尚不清楚,有待于開(kāi)展更深、更細(xì)致的研究。而pEGFP-N1-UCH-L1重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建,為轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞,促進(jìn)UCH-L1的表達(dá),進(jìn)一步研究該基因在缺鋅致認(rèn)知功能損傷中的作用機(jī)制提供了有力載體。

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