RNA干擾抑制Galectin-3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀影響研究進(jìn)展

吳雪艷，江小華

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063009;2.承德醫(yī)學(xué)院)

腫瘤是全球疾病致死的重要元兇之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球新腫瘤患者每10萬人中就有173人，在中國(guó)每10萬人中有110人。抑制癌的增殖，促進(jìn)其凋亡，可達(dá)到降低死亡率的目的,有效敲除與癌有關(guān)的基因的表達(dá)可望降低腫瘤的發(fā)生率。干擾技術(shù)作為一種從反向研究基因，特別是癌基因的生物學(xué)作用, 已經(jīng)被用到基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。Galectin-3是目前認(rèn)為與腫瘤發(fā)展關(guān)系密切的基因，近年來，隨著RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用，人們對(duì)抑制Galectin-3表達(dá)后腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變研究越來越多，本文對(duì)此做一綜述。

1 Galectin-3的結(jié)構(gòu)與功能

β-半乳糖苷結(jié)合蛋白-3(Galectin-3)屬于動(dòng)物凝集素，是β半乳糖凝集素的成員之一，它包括三個(gè)結(jié)合域:NH2末端結(jié)合域、一個(gè)糖結(jié)構(gòu)識(shí)別域(carbohydrate recognition domain，CRD)和一個(gè)特有的富含甘氨酸、脯氨酸和酪氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域[1]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞凋亡[2,3]、介導(dǎo)細(xì)胞黏附[4]、參與新生血管形成[5]、調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等作用，在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與細(xì)胞內(nèi)糖蛋白、細(xì)胞表面分子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用，參與許多生理和病理過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成，以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

2 Galectin-3與腫瘤

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是正常細(xì)胞在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂下產(chǎn)生的惡性轉(zhuǎn)化和異型增生。Yoshii等[6]和Takenaka等[7]研究發(fā)現(xiàn)，正常甲狀腺濾泡細(xì)胞轉(zhuǎn)染Galectin-3 cDNA后，Galectin-3表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞獲得惡性表型，提示Galectin-3可能在維持甲狀腺癌細(xì)胞的惡性表型中發(fā)揮作用。很多研究表明，Galectin-3的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度有密切關(guān)系。Camby等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3的表達(dá)水平隨著星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤分級(jí)增高而上升，Galectin-3在體外明顯刺激膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的移動(dòng)。Yang等[9]通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3在正常胃黏膜為弱表達(dá)，表達(dá)水平很低，而胃癌原發(fā)灶、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶中Galectin-3 mRNA表達(dá)增高。這提示Galectin-3與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性特征密切相關(guān)。

3 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的特異同源靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的過程[10]。RNAi可以通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA，誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)阻止基因表達(dá)。故RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的可代替基因敲除技術(shù)來抑制特定基因表達(dá)。

RNAi引發(fā)基因沉默大致分為三個(gè)階段:起始階段、效用階段、擴(kuò)增階段。(1)起始階段:dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被一雙鏈RNA酶III型內(nèi)切酶(如Dicer酶)切割產(chǎn)生siRNA片斷;(2)效應(yīng)階段:siRNA與RNAi特異性的核酸內(nèi)、外切酶及其它一些蛋白等一起形成核糖核苷酸蛋白復(fù)合物(RNA inducing silencing complex,RISC)，RISC 的核酸部分起到靶向性的作用，蛋白部分則起到降解mRNA的作用;(3)擴(kuò)增階段:siRNA與mRNA靶向性結(jié)合，并作為引物，在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，新形成的dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以進(jìn)入下一輪循環(huán)而達(dá)到擴(kuò)增效應(yīng)的目的，一個(gè)完整的mRNA被降解成多個(gè)21-23nt的小片段，從而導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)沉默。

RNAi具有高效性、高特異性、遺傳性、可傳播性、靶基因位點(diǎn)的高選擇性與濃度、時(shí)間及ATP依賴性等幾個(gè)特點(diǎn)。

4 RNA干擾抑制Galectin-3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響

4.1 惡性膠質(zhì)瘤 腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，約占腦腫瘤的45%左右，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，顯微手術(shù)難以達(dá)到組織學(xué)全切除，手術(shù)效果差，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，死亡率高，而且對(duì)放化療不敏感，傳統(tǒng)藥物因神經(jīng)毒性和血腦屏障等因素，療效不理想，導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤至今仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一。因此，深入研究惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找相關(guān)的惡性轉(zhuǎn)化基因，實(shí)現(xiàn)重要靶向分子的特異性治療和個(gè)體化治療，是治療惡性復(fù)發(fā)腫瘤的根本途徑。邢變枝等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在人腦膠質(zhì)瘤中，Galectin-3的表達(dá)與腫瘤的WHO分級(jí)有關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤惡性程度分級(jí)的重要指標(biāo)。李曉明等[12]將Galectin-3特異性siRNA轉(zhuǎn)染人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG，降低U87MG細(xì)胞Galectin-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的Galectin-3RNAi穩(wěn)定細(xì)胞株在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下，細(xì)胞凋亡率顯著高于野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體穩(wěn)定細(xì)胞株(P<0.05);同樣，在細(xì)胞增殖檢測(cè)中，Galectin-3 RNAi穩(wěn)定細(xì)胞株細(xì)胞增長(zhǎng)率顯著低于野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體穩(wěn)定細(xì)胞株(P<0.05)。上述結(jié)果說明，Galectin-3在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 MG中起著抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，Galectin-3應(yīng)該成為該類腫瘤治療的強(qiáng)有力的靶向基因和腫瘤個(gè)性化(腫瘤細(xì)胞中Galectin-3高表達(dá))治療的一種選擇。

4.2 乳腺癌 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。在歐美國(guó)家，乳腺癌占女性惡性腫瘤的25%-30%。20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界每年約有130萬人診斷為乳腺癌，而有40萬人死于該病。在我國(guó)許多大城市，乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)上升為女性惡性腫瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成為婦女健康的最大威脅。魏楊輝等[13]將設(shè)計(jì)并化學(xué)合成Galectin-3小干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，熒光倒置顯微鏡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾結(jié)果，MTT法觀察干擾后24、48、72、96h各組細(xì)胞增殖吸光度(A)值，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)比較不同組間細(xì)胞遷移和侵襲情況。結(jié)論是RNA干擾能抑制Galectin-3的表達(dá)及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低其遷移侵襲能力。

4.3 大腸癌 大腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤。近年來, 我國(guó)大腸癌的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢(shì), 在惡性腫瘤發(fā)病率中排第四位，而腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后差和死亡的主要原因。因此，有效控制大腸癌的發(fā)展是患者長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵。張楠等[14]研究發(fā)現(xiàn),Galectin -3蛋白在大腸癌組織、癌旁組織及腺瘤中的表達(dá)有明顯差異;Galectin-3的表達(dá)與大腸癌組織的分化程度、浸潤(rùn)深度及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Nakamura[15]研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3在大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)比大腸癌原發(fā)灶中的要高，兩者表達(dá)均值相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Galectin-3在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中有重要作用。但也存在些不一致的結(jié)論，有報(bào)道認(rèn)為結(jié)腸癌進(jìn)展時(shí)Galectin-3表達(dá)增高[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)腸癌進(jìn)展時(shí)其表達(dá)降低[17]。程變巧等[18]用Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞系LOVO細(xì)胞，檢測(cè)Galectin-3低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響，得到的結(jié)論是干擾后細(xì)胞增殖減慢,凋亡增加。

4.4 食管癌 石菲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3蛋白在食管癌組織、正常食管組織中的表達(dá)具有明顯差異(P<0.05)，Galectin-3 mRNA的陽性表達(dá)率在食管癌組織中明顯升高，與食管癌的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這提示Galectin-3與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。鄒國(guó)紅等[20]將Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞后，用RT-PCR、MTT、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期分布及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27 蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌Eca-109細(xì)胞增殖活性明顯減少，主要分布在G1期，CyclinD1和Galectin-3蛋白表達(dá)下降，p27和p21蛋白的表達(dá)升高。表明運(yùn)用siRNA可有效抑制Galectin-3蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖活性，Galectin-3參與食管癌Eca-109細(xì)胞株的增殖，與CyclinD1、p21、p27蛋白關(guān)系密切，Galectin-3可成為治療食管癌的靶基因。

5 結(jié)語

Galectin-3對(duì)某些腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)有重要意義。但是，Galectin-3的許多生物學(xué)功能和效應(yīng)機(jī)制仍未完全清晰，利用RNAi技術(shù)可以有效抑制靶基因Galectin-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，Galectin-3可能成為治療腫瘤細(xì)胞靶向治療的新基因。

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