微生物全基因組測序在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

崔玉軍，楊瑞馥

微生物全基因組測序在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

崔玉軍，楊瑞馥

病原微生物引起傳染病疫情時，預(yù)防醫(yī)學(xué)工作者會面臨以下幾個重要問題：①病原從哪里來，可能的傳播途徑是什么；②病原有哪些生存能力、毒力和耐藥特性；③病原所致疾病有著怎樣的流行規(guī)律。高通量測序技術(shù)以及與之相伴的信息學(xué)分析技術(shù)的飛速發(fā)展，為上述問題提供了新的思路和解決方案。本文從流行病學(xué)調(diào)查溯源、病原體特性的快速判定、疾病流行規(guī)律分析以及疫苗變異監(jiān)測和使用效果評價四個方面，總結(jié)歸納了新一代全基因組測序技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用實例，并對該研究方向存在的問題及未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

基因組；微生物學(xué)；序列分析；流行病學(xué)研究；病原

傳染病疫情暴發(fā)嚴(yán)重危害人類健康，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是新型病原微生物出現(xiàn)并迅速擴(kuò)散時，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征、新型禽流感、德國出血性大腸桿菌疫情等，還會引起社會的普遍影響。預(yù)防醫(yī)學(xué)工作者對疾病的流行規(guī)律，以及對引起疾病的病原微生物本身缺乏足夠認(rèn)識，是很多情況下疫情防控措施不夠合理的重要原因；而缺乏對新型病原和疾病的了解，是導(dǎo)致民眾產(chǎn)生恐慌的因素之一。因此，在疫情出現(xiàn)早期，快速獲得病原特性，掌握疾病流行規(guī)律，是實現(xiàn)有效防控的重中之重。

對病原微生物的全基因組序列測定可以迅速提供疫情防控所需要的信息[1-4]。基因組是遺傳物質(zhì)的載體，也是形成微生物特定表型的本源。在疾病流行過程中，病原體的基因組會以一定速率發(fā)生變異，這些變異忠實記錄了病原傳播所經(jīng)歷的自然選擇和遺傳漂變的作用[5]。因此，測定病原微生物的全基因組序列，并應(yīng)用比較基因組學(xué)和群體遺傳學(xué)的分析方法研究這些序列及其變異情況，將能夠預(yù)測病原微生物的重要表型，并反演病原傳播的途徑和選擇壓力。這些信息的獲得將為針對性預(yù)防治療和傳播過程追溯提供必要的數(shù)據(jù)支持。

在過去30年中，基于基因組序列片段的分子分型方法與流行病學(xué)技術(shù)的結(jié)合極大地豐富了我們對病原的認(rèn)識，脈沖場凝膠電泳、多位點串聯(lián)重復(fù)序列分析、多位點序列分型（multilocus sequence typing,MLST）等技術(shù)已經(jīng)在國家疾病防控體系中廣泛應(yīng)用。但是直到近十年前，分辨率最高的全基因組序列分析卻始終徘徊在主流預(yù)防醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域之外，其主要原因是基于雙脫氧鏈終止法的第一代核酸測序技術(shù)成本過高，且進(jìn)行全基因組測序的周期太長（通常需要整年的時間），不適合常規(guī)監(jiān)測以及應(yīng)對突發(fā)疫情的需要。2005年起，新一代測序技術(shù)走上歷史舞臺，將單個細(xì)菌全基因組序列測定所需的時間從1年縮短到幾天甚至幾個小時，測序成本也大幅度降低[6]，至此全基因組測序技術(shù)才真正跨越基礎(chǔ)研究的范疇，開始走入預(yù)防醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的廣闊天地，并為該領(lǐng)域的研究帶來革命性變革[4，7]。本文從流行病學(xué)調(diào)查和溯源、病原體特性預(yù)測、疾病流行規(guī)律分析、疫苗變異監(jiān)測和使用效果評價4個方面，對全基因組測序技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 流行病學(xué)調(diào)查和溯源

全基因組測序技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)中最直接的應(yīng)用就是流行病學(xué)調(diào)查分析。病原體在不同宿主、媒介中復(fù)制和傳播時，其基因組變異會以一定概率發(fā)生并累積下來。通過全基因組測序檢測這些變異，并利用比較基因組學(xué)和群體遺傳學(xué)分析手段重建樣本間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可以推測不同來源的病原體之間的傳播關(guān)系，從而為流行病學(xué)和微生物法醫(yī)學(xué)調(diào)查提供更完善的證據(jù)和補充。

此類研究最早應(yīng)用于加拿大的一起社區(qū)胸膜結(jié)核疫情的回顧性流行病學(xué)調(diào)查[8]。該社區(qū)在2年時間里陸續(xù)觀察到41例患者。Gardy等[8]對來自患者的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，并與傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)獲得的患者社會網(wǎng)絡(luò)互相疊加，精確判定了傳染源和傳播途徑。研究發(fā)現(xiàn)了引起多人感染的超級傳播者，并證明疫情實際由2起同時發(fā)生，但具有各自獨立傳播途徑的流行組成。該研究首次將全基因組序列分析整合到傳統(tǒng)流行病學(xué)研究中，有力證明了全基因組測序技術(shù)在流行病學(xué)調(diào)查中的作用。

全基因組測序的高分辨率特性使其在院內(nèi)感染調(diào)查中起到不可替代的作用。2009年，英國劍橋醫(yī)院的新生兒監(jiān)護(hù)病房發(fā)生了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）感染流行[9]。由于同一家醫(yī)院的MRSA分離株遺傳距離非常接近，傳統(tǒng)分型方法無法檢測出不同患者M(jìn)RSA分離株之間的差異，也無法判斷院內(nèi)感染源頭和傳播途徑。而結(jié)合全基因組測序分析以及菌株的分離時間等信息，研究者得以清楚區(qū)分暴發(fā)菌株和普通患者攜帶的非暴發(fā)菌株，從而排除非暴發(fā)菌株攜帶者對流行病學(xué)調(diào)查造成的干擾，確定疫情流行的過程。另一個典型例子是對碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌院內(nèi)暴發(fā)的分析[10]。該研究將全基因組序列分析結(jié)果與患者出、入院及住院病房等資料結(jié)合，鑒定出傳染源是一例患者，并發(fā)現(xiàn)該患者通過3條獨立的傳播路徑引起其他17例院內(nèi)感染。其中有2條傳播途徑涉及到無癥狀攜帶者以及醫(yī)院下水道、通風(fēng)系統(tǒng)等，這是通過基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)而被傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查手段所忽略的。因此，基因組分析能夠豐富傳統(tǒng)流行病學(xué)研究結(jié)果，為制訂有效防控措施奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

全基因組序列分析還可應(yīng)用于跨大洲的國際流行病學(xué)溯源研究。2010年10月，海地暴發(fā)了百年來首次霍亂疫情。疫情源頭是來自拉丁美洲本地菌株還是聯(lián)合國維和部隊帶來的外來菌株，曾一度引起強(qiáng)烈爭議[11]。通過對2株暴發(fā)菌株進(jìn)行測序，并與拉丁美洲流行株和亞洲菌株序列進(jìn)行比較，研究人員初步得到了問題答案：海地霍亂暴發(fā)不是拉丁美洲當(dāng)?shù)鼐晁拢怯捎谌祟惢顒訌倪b遠(yuǎn)的外地帶入[12]。通過對更多暴發(fā)菌株及全球霍亂代表株進(jìn)行全基因組序列分型（whole genome sequence typing, WGST），研究者發(fā)現(xiàn)南亞尼泊爾地區(qū)與海地的霍亂分離株WGST結(jié)果一致。尼泊爾分離的霍亂菌株可分為4個遺傳發(fā)育分枝，海地暴發(fā)菌株是其中之一，與該分支其他尼泊爾菌株之間僅存在1或2個堿基的差異，證明海地霍亂暴發(fā)菌株來源于尼泊爾地區(qū)[13]。上述分析為WHO對海地霍亂流行病學(xué)調(diào)查的最終結(jié)論提供了堅實證據(jù)，成為認(rèn)識疫情流行規(guī)律與實施有效防控措施的關(guān)鍵。

2 病原體特性的快速判定

通過對病原體全基因組序列的功能注釋，以及與毒力因子數(shù)據(jù)庫（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main. htm）、耐藥基因數(shù)據(jù)庫（http://ardb.cbcb.umd.edu）等進(jìn)行查詢比對[14-15]，可以預(yù)測包括病原體環(huán)境生存能力、毒力及耐藥譜等的重要表型特性，為臨床用藥給予指導(dǎo)。盡管表型試驗成本相對較低，也容易在普通實驗室實現(xiàn)，但基于全基因組序列的病原體特性預(yù)測對于新型病原體和生長速度非常慢的病原體仍然有非常高的實用價值。

2011年5—7月，大腸桿菌疫情在德國北部暴發(fā)，很快席卷整個德國和歐洲部分國家，并蔓延至美國和加拿大。合計感染人數(shù)達(dá)4000例以上，其中三分之一以上病例發(fā)展為溶血性尿毒綜合征，超過50例死亡。盡管患者癥狀表現(xiàn)為典型的腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC）感染，但病原培養(yǎng)特性和MLST分析卻發(fā)現(xiàn)暴發(fā)菌株與EHEC差距甚遠(yuǎn)，因此懷疑該菌株是一種新型致病性大腸桿菌[16-17]。我們在疫情暴發(fā)之初，應(yīng)用Ion Torrent PGM測序儀3 d內(nèi)完成了暴發(fā)菌株的測序，迅速確定了病原的性質(zhì)[18]。將暴發(fā)菌株與當(dāng)時已發(fā)表的30株大腸桿菌完成圖序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明導(dǎo)致暴發(fā)的菌株與腸聚集性大腸桿菌屬于同一進(jìn)化分支，但由于獲得了編碼志賀毒素的stx2基因，從而表現(xiàn)出EHEC的致病特點。對暴發(fā)菌株序列的注釋結(jié)果表明，該菌株還攜帶了Ⅰ型聚集性粘附菌毛蛋白等毒力因子，以及27個耐藥基因和19個重金屬抗性基因，其中耐藥基因預(yù)測結(jié)果與德國科赫研究所公布的暴發(fā)菌株耐藥表型譜高度一致。上述遺傳因子可能增強(qiáng)了該菌株的環(huán)境生存能力，從而促進(jìn)病原的大范圍傳播。以上研究結(jié)果為認(rèn)清病原特性、制訂針對性防控措施提供了重要依據(jù)，也為暴發(fā)菌株的特異性檢測方案設(shè)計打下基礎(chǔ)[19]。

抗生素耐藥的全球擴(kuò)散是WHO提出的威脅人類健康的全球三大首要問題之一，而結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究一直是該領(lǐng)域的熱點[20]。由于結(jié)核分枝桿菌生長速度極慢，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型方法進(jìn)行耐藥譜檢測，至少要花費幾個星期。2013年新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表的一篇報道中，研究者將患者痰液放入分枝桿菌生長指示試管（mycobacterial growth indicator tube,MGIT）中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后直接從培養(yǎng)物中提取DNA，并使用IlluminaMiSeq測序儀進(jìn)行測序[21]。結(jié)果鑒定出患者混合感染了2種不同的結(jié)核多耐藥菌株，并通過耐藥基因的變異情況預(yù)測了耐藥譜。通過序列分析獲得的耐藥譜準(zhǔn)確包含了參考實驗室通過培養(yǎng)檢測得到的全部9種抗生素的耐藥情況，并預(yù)測菌株可能對另外5種抗生素耐藥（參考實驗室未進(jìn)行實驗驗證）。這項研究利用全基因組測序技術(shù)，將結(jié)核分枝桿菌耐藥譜檢測時間從幾個星期縮短到幾天，其推廣應(yīng)用將為結(jié)核分枝桿菌耐藥的臨床診斷帶來革命性變化。

3 疾病流行規(guī)律分析和預(yù)測

使用群體遺傳學(xué)方法，對病原體的歷史分離株進(jìn)行全基因組序列分析和進(jìn)化研究，可以推測病原的長期流行情況，深入認(rèn)識其所致疾病的流行規(guī)律。

流感是最常見的呼吸道傳染病，每年在全球造成幾十萬人死亡。通過北半球（美國紐約）和南半球（新西蘭）在12年間分離的上千株甲型流感病毒的序列分析，Rambaut等[22]提出了流感流行的“源庫模型”（source-sinkmodel）。他們推測，流感病毒的遺傳多樣性在位于熱帶地區(qū)的宿主種群中（source）持續(xù)產(chǎn)生，并在強(qiáng)烈的自然選擇作用下發(fā)生抗原漂變等變異。隨后，在熱帶地區(qū)變異后的流感病毒季節(jié)性傳播到南北半球的溫帶地區(qū)（sink）并在當(dāng)?shù)卦斐闪餍?。因此，要從根源上遏制流感疫情，不僅要對流行區(qū)域進(jìn)行疫苗接種等防控措施，還須要重視對熱帶地區(qū)流感宿主種群的研究。

鼠疫菌是對人類歷史影響最深遠(yuǎn)的病原之一，曾導(dǎo)致3次世界范圍的大流行。但由于缺乏病原學(xué)證據(jù)，前2次大流行（公元6世紀(jì)的查士丁尼瘟疫和14—17世紀(jì)的中世紀(jì)黑死?。┦欠駷槭笠呔略趯W(xué)術(shù)界一直有爭議。直到近年來，通過對死于前2次瘟疫的患者尸骨中提取的古DNA進(jìn)行全基因組測序，才為這些爭議蓋棺定論[23-24]。分析結(jié)果顯示，古DNA與現(xiàn)代鼠疫桿菌在核心基因組上僅存在幾百個單堿基差異，證明2次流行確實是鼠疫桿菌所致。造成2次流行的鼠疫桿菌分屬于不同的進(jìn)化分支，其中引起第1次大流行的分支已經(jīng)在進(jìn)化長河中消失；而引起第2次大流行的分支被保留下來，其后代在進(jìn)化了幾百年后又導(dǎo)致了第3次世界大流行[24]。對全球代表性鼠疫桿菌分離株的全基因組測序和分析進(jìn)一步加深了我們對鼠疫流行規(guī)律的認(rèn)識。研究結(jié)果表明鼠疫可能起源于中國青藏高原東部，并通過絲綢之路、茶馬古道和唐蕃古道等古商貿(mào)途徑傳播到世界其他地區(qū)，說明人類活動在鼠疫傳播中起到重要作用[25-26]。

通過適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法對病原體基因組變異進(jìn)行解析，可以推測產(chǎn)生變異的系統(tǒng)發(fā)育過程，以及進(jìn)化傳播過程中的各種重要參數(shù)，包括傳播速度、基礎(chǔ)復(fù)制率、采樣比率、有效種群大小等。Stadler等[27]應(yīng)用基于貝葉斯方法開發(fā)的存亡輪廓線模型（birth-death skyline plot,BDSP）對HIV基因組序列進(jìn)行分析，重現(xiàn)了由于成功應(yīng)用雞尾酒療法，英國的B型HIV-1有效復(fù)制率和種群多樣性在20世紀(jì)90年代開始呈現(xiàn)明顯下降的趨勢；并指出在90年代中期之后，由于高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的產(chǎn)生，HIV的有效復(fù)制率開始低于1，提示流行趨勢已得到控制。該方法還被應(yīng)用于63株埃及分離的HCV的序列分析，結(jié)果清晰顯示了20世紀(jì)初由于抗血吸蟲注射療法造成埃及HCV感染急劇增加，而在70年代之后，由于口服療法逐漸取代了注射療法，HCV感染率及有效種群也隨之下降[27]。BDSP方法從數(shù)學(xué)層面將基因組序列變異和疾病流行規(guī)律結(jié)合起來，在將來疾病流行趨勢分析中將發(fā)揮重要作用。

4 疫苗變異監(jiān)測和使用效果評價

利用全基因組序列分析，我們還可以對疫苗株的變異及使用效果進(jìn)行監(jiān)測和評價。EV76是鼠疫耶爾森菌減毒活疫苗，曾在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于鼠疫預(yù)防接種。通過對中國保藏的EV76-CN株進(jìn)行全基因組測序，并與鼠疫桿菌野生株進(jìn)行比較分析，我們鑒定出疫苗株發(fā)生了12個突變（6個單核苷酸多態(tài)性和6個插入缺失）。選擇更多來自不同研究所和國際保藏中心的EV76疫苗株，對這些突變位點進(jìn)行了掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗在各個國家之間轉(zhuǎn)移、運輸和生產(chǎn)的過程中，至少已形成5個種系，并發(fā)現(xiàn)中國使用的EV76株存在3個獨立的來源[28]?；蚪M水平的遺傳變異可能導(dǎo)致疫苗株表型變化，進(jìn)而影響接種后的免疫效果，因此我們的發(fā)現(xiàn)將有助于闡明各批次疫苗的免疫效力不同的問題，為疫苗的質(zhì)量監(jiān)測提出了新的思路。

美國從2000年開始，大范圍應(yīng)用肺炎球菌脂多糖-蛋白質(zhì)聯(lián)合七價疫苗（PCV7）。與此同時，能逃避疫苗的肺炎鏈球菌菌株在種群中的頻率開始上升。2012年，Golubchik等[29]通過對62株19A血清型肺炎鏈球菌的測序分析表明，同源重組造成關(guān)鍵遺傳片段在菌株間的水平轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致疫苗逃避的最重要原因。研究還發(fā)現(xiàn)，在重組造成莢膜轉(zhuǎn)換，從而逃避疫苗作用的同時，大量其他未知功能的基因組片段也通過搭車效應(yīng)轉(zhuǎn)移到受體菌中。因此，疫苗的大規(guī)模應(yīng)用會對細(xì)菌種群的進(jìn)化產(chǎn)生一些難以預(yù)料的后果。2013年，Croucher等[30]進(jìn)一步研究了肺炎鏈球菌種群在疫苗作用下的進(jìn)化機(jī)制，通過616株無癥狀攜帶者分離的肺炎鏈球菌基因組序列比對，研究者在莢膜生物合成基因簇、抗原蛋白編碼基因PspA和PspC等基因元件中觀察到了顯著的重組事件。結(jié)合近十年的流行病學(xué)資料進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)：重組對整個種群的血清型轉(zhuǎn)換和耐藥譜產(chǎn)生了影響，受到免疫的7個血清型幾乎完全消失，取而代之的是非疫苗免疫的型別。但接種疫苗前后物種的基因庫基本沒有發(fā)生變化，因此盡管兒童患病率顯著下降，肺炎鏈球菌的無癥狀攜帶者比例與疫苗使用前相比無顯著差別。以上研究讓我們了解到大規(guī)模疫苗接種行為對病原體種群組成的影響，這為將來疫苗的針對性設(shè)計提供了依據(jù)。

5 問題與展望

盡管已經(jīng)在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，但全基因組測序技術(shù)要真正進(jìn)入基層疾病監(jiān)測機(jī)構(gòu)和醫(yī)院，仍然有很長一段路要走。首先要解決的是成本問題。目前上市的測序儀主要為人類基因組研究設(shè)計，而普通細(xì)菌基因組大小僅為人類基因組大小的千分之一。進(jìn)行微生物基因組測序時，為了降低成本，往往須要把幾十甚至上百株樣品的DNA加上標(biāo)簽后混合測序。這對于群體遺傳學(xué)研究是非常合適的，但限制了其在臨床上的應(yīng)用。第二個要解決的問題是測序前樣本的快速處理。如果按照傳統(tǒng)測序方法，先對菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，再大量提取DNA進(jìn)行測序，其整個周期將仍然很長，難以體現(xiàn)快速全基因組序列分析的優(yōu)勢。盡管已有一些實驗室解決方案被提出，如上文中提到的利用MGIT方法對結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)測序[21]，以及在非培養(yǎng)條件下，對樣本DNA進(jìn)行富集后測序[31]，或者直接進(jìn)行宏基因組或者單細(xì)胞測序等[32-33]，但這些方法的大規(guī)模臨床應(yīng)用還存在技術(shù)和成本屏障。第三個問題是海量數(shù)據(jù)的儲存管理及自動化分析。高通量實驗技術(shù)使得數(shù)據(jù)產(chǎn)生相對容易，而對數(shù)據(jù)的解析和管理成為科研的瓶頸。尤其對于疾病防控工作者和醫(yī)生來講，在日常工作中去對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析是不現(xiàn)實的，必須開發(fā)數(shù)據(jù)庫和自動化分析平臺，實現(xiàn)從序列到結(jié)果解讀的“一鍵化”操作。

可以設(shè)想未來傳染病防控工作的一個場景：工作人員采集到患者體液樣本，在實驗室經(jīng)過簡單處理和平板培養(yǎng)，長出單菌落后，將其分成兩部分，一部分用于提取DNA測序，另一部分繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行表型試驗。幾個小時內(nèi)獲得測序結(jié)果后，可直接導(dǎo)入普通筆記本電腦預(yù)裝的軟件（或網(wǎng)絡(luò)分析平臺），軟件在幾分鐘內(nèi)自動給出標(biāo)準(zhǔn)格式的病原特性和溯源分析報告。測序分析結(jié)果與表型試驗相互印證，為患者臨床治療和疾病流行控制提供迅速有效的指導(dǎo)。這個場景令人鼓舞與期待。

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（2014-07-25收稿 2014-08-01修回）

（責(zé)任編委 毛遠(yuǎn)麗 本文編輯 王 姝）

Application ofm icrobialwhole-genome sequencing technology in the area of preventivemedicine

CUIYu-jun,YANG Rui-fu*
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:ruifuyang@gmail.com

When being faced with infectious disease caused by a specific pathogen,several immediate questions need to be addressed to make effective prevention and control strategy.Firstly,where does the pathogen come from,and what is the possible transmission pathway?Secondly,what are the surviving,virulent and antibiotic resistance features of the etiologic agent?Thirdly, what kind of epidemiological pattern of a disease is revealed by the pathogen's genomic analysis?Dramatic development of highthroughput sequencing technology and bioinformatic analysis strategy has provided novel solutions to these questions in recent years. In this review,the authors summarize the successful application cases of the next-generation whole-genome sequencing technology in the area of preventive medicine,including epidemiological investigation for source-tracing,rapid identification of pathogen's features,epidemiological characteristics of a disease,and surveillance and evaluation of live attenuated vaccine variations,and also discuss the questions presenting in current stage and propose the possible scenario of this research area in the future.

genome;microbiology;sequence analysis;epidemiologic study;pathogen

R394.21；R37

A

1007-8134(2014)05-0274-05

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10004215）；國家衛(wèi)生行業(yè)科研專項（201202012）

100071北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原與生物安全國家重點實驗室（崔玉軍、楊瑞馥）

楊瑞馥，E-mail:ruifuyang@gmail.com