骨形態(tài)發(fā)生蛋白9介導(dǎo)的成骨及其調(diào)控研究進(jìn)展

譚富強(qiáng)，劉 渤

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)最初是在Urist研究脫鈣的骨基質(zhì)可誘導(dǎo)骨形成中被發(fā)現(xiàn)[1]，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一,在骨骼發(fā)育、骨形成和干細(xì)胞分化中起著至關(guān)重要的作用。人類中被鑒定的BMP至少有15種，其中BMP2、4、6、7和9具有成骨能力，而BMP9是目前公認(rèn)的BMP家族中成骨能力最強(qiáng)的蛋白。BMP9也被稱為生長分化因子2(growth differentiation factor 2，GDF-2)，最初是胎鼠肝cDNA文庫中分離而來，可在小鼠肝臟中高表達(dá)并刺激干細(xì)胞增殖[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，BMP9在調(diào)節(jié)糖脂代謝及造血細(xì)胞功能、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化，調(diào)控血管生成及腫瘤發(fā)生等方面均具有重要作用。而在BMP9成骨研究領(lǐng)域，近年也取得了較多進(jìn)展。

1 BMP9的結(jié)構(gòu)特點

人的BMP9位于10 q11.22染色體，其前體蛋白包含428個氨基酸殘基，與BMP2、4、5、6、7、8分子前體蛋白的氨基酸序列50%～55%相同，BMP9前體蛋白能維持成熟BMP9的功能及穩(wěn)定性。BMP9具有蝴蝶樣構(gòu)型的半胱氨酸支架結(jié)構(gòu)，包含1個α螺旋表位和2個從中心延伸出的β片層，BMP9與其他BMP表現(xiàn)出的受體結(jié)合差異性與其螺旋袢上的殘基及結(jié)合界面上的氨基酸不同有關(guān)[3]。

2 BMP9的成骨作用

2.1BMP9誘導(dǎo)成骨 Kang等[4]通過重組腺病毒AdEasy系統(tǒng)介導(dǎo)的方法，成功構(gòu)建了AdBMP2～AdBMP15等14種腺病毒，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后結(jié)果顯示BMP2、6、7、9均能在體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成，其中BMP9誘導(dǎo)成骨效應(yīng)最強(qiáng)； 直接肌肉注射AdBMPs誘導(dǎo)的原位成骨效應(yīng)較AdBMPs轉(zhuǎn)染成骨祖細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨效應(yīng)弱，提示基于成骨祖細(xì)胞或干細(xì)胞的基因治療是促進(jìn)骨再生更有效的方法。Sheyn等[5]首次利用超聲微泡技術(shù)將成骨基因?qū)胄∈蠊伤念^肌內(nèi)，通過熒光素酶的表達(dá)、微型CT及組織學(xué)分析，結(jié)果顯示重組人BMP9直接的聲孔效應(yīng)可引起異位骨的形成； 利用一種新型的電穿透技術(shù)，Aslan等[6]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)和BMP9進(jìn)行核轉(zhuǎn)染，4周后可觀察到骨組織形成?？梢?，BMP9是一種強(qiáng)有力的骨形成誘導(dǎo)因子。

2.2BMP9與骨再生 近年研究發(fā)現(xiàn)，BMP9在促進(jìn)脊柱融合和修復(fù)骨缺損中具有重要作用。Dumont等[7]經(jīng)皮向16只裸鼠腰部棘突與椎板之間注射AdBMP9轉(zhuǎn)染的hMSCs，8周后，CT掃描和組織學(xué)分析均證實在注射區(qū)域即腰椎棘突、椎板與關(guān)節(jié)突之間有大量的異位骨形成，脊柱融合獲得成功。Kimelman-Bleich等[8]通過建立小鼠的骨不連模型，明膠海綿填充骨缺損處，10d后利用BMP9治療，可在骨缺損處形成骨橋并修復(fù)骨不連。在研究BMP9誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞成骨分化過程中，Li等[9]建立小鼠橈骨12mm骨缺陷模型，相比于BMP2對照組，BMP9處理組在骨缺損區(qū)域表現(xiàn)出更快、更多的骨橋形成。由此可見，BMP9具有強(qiáng)大的促骨再生作用。

3 BMP9成骨信號及其調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，BMP9誘導(dǎo)成骨作用不被公認(rèn)的成骨抑制劑骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(BMP3)及頭蛋白(Noggin)所抑制，提示BMP9有特殊的成骨機(jī)制[4，10]。BMP9具有成骨功能的I型受體活化素受體樣激酶1、2(ALK1、2)[11]和Ⅱ型受體骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPRⅡ)、激活素Ⅱ型受體(ActRⅡ)[12]已被成功鑒定。在其成骨調(diào)控機(jī)制研究方面，近年來取得了較多進(jìn)展。

3.1BMP9成骨信號調(diào)控因子

3.1.1正向調(diào)控因子

3.1.1.1多毛/增強(qiáng)的分裂相關(guān)阻遏蛋白1(hairy/enhancer of split-related repressor protein 1，Hey1) Hey1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制劑家族成員之一，是Notch信號途徑的關(guān)鍵靶點。Sharff等[13]研究證實Hey1是BMP9介導(dǎo)的MSCs成骨早期上調(diào)最顯著的基因之一； 染色質(zhì)免疫沉淀分析證明Hey1是BMP9誘導(dǎo)的Smad信號通路的直接靶點。增加Hey1表達(dá)可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)成骨分化，而沉默Hey1基因則降低成骨分化能力， 提示Hey1在BMP9誘導(dǎo)的Smad蛋白成骨信號通路中起正調(diào)控作用。

3.1.1.2過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ) PPAR-γ是成脂和成骨關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，可結(jié)合脂肪酸衍生物并誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞向終末脂肪細(xì)胞分化。Kang等[14]發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)PPAR-γ2可刺激BMP9促進(jìn)MSCs成骨和成脂分化； 在敲除PPAR-γ2的MSCs中和在PPAR-γ2-/-的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast，MEF)中，BMP-9介導(dǎo)的成脂和成骨作用均減弱，提示PPAR-γ2是BMP9介導(dǎo)的成骨分化作用中的正調(diào)控因子。

3.1.1.3DNA結(jié)合抑制因子(inhibitor of DNA binding,Id) 與Hey1類似，Id對堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用。目前研究表明，DNA結(jié)合抑制因子1、2、3(Id-1、2、3)基因在BMP9處理后早期階段顯著上調(diào)，3d后降至基礎(chǔ)水平； 利用RNA干擾技術(shù)抗默該3種基因或過表達(dá)該3種基因，均顯著減弱BMP9誘導(dǎo)的成骨分化[15]。由此可見，Id基因能在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化早期階段發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

3.1.1.4結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF) CTGF是即刻早期基因CCN家族成員之一，在骨形成、軟骨細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育中起重要作用。與Id基因相似，CTGF在BMP9誘導(dǎo)的早期階段表達(dá)，5d后降到基礎(chǔ)水平； siRNA介導(dǎo)的CTGF基因沉默和CTGF組成性過表達(dá)均消弱BMP9介導(dǎo)的MSCs成骨分化； 外源性表達(dá)的CTGF可促進(jìn)細(xì)胞遷移和MSCs的募集，由此推測，CTGF在BMP9介導(dǎo)的MSCs早期成骨分化中可調(diào)控成骨祖細(xì)胞的增殖和募集[16]。

3.1.1.5缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α) HIF1α是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，可同時激活血管生成信號和BMP9介導(dǎo)的MSCs成骨信號。BMP9可通過Smad1/5/8信號途徑直接誘導(dǎo)MSCs中HIF1α表達(dá)； 外源性的HIF1α過表達(dá)能協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化； 而沉默HIF1α基因顯著抑制BMP9介導(dǎo)的成骨，提示HIF1對BMP9的成骨效應(yīng)具有協(xié)同作用[17]。

3.1.1.6環(huán)氧酶2(cyclo-oxygen-ase 2,COX-2) COX-2是應(yīng)激后迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，催化前列腺素(PGs)合成，參與炎癥反應(yīng)。最近研究表明[18]，COX-2可在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中作為直接靶點上調(diào)； 使用COX-2抑制劑NS-398和基因敲除COX-2均可有效減弱BMP9誘導(dǎo)的早、晚期成骨標(biāo)志物表達(dá)及基質(zhì)礦化； 敲除COX-2基因明顯降低磷酸化Smad 1、5、8蛋白活性，抑制Smad6、Smad7及核心結(jié)合蛋白因子2(Runx2)、遠(yuǎn)端缺失同源盒5(DLX-5)的表達(dá)，從而抑制骨形成。COX-2通過與BMP9形成重要的調(diào)節(jié)環(huán)路在BMP9介導(dǎo)的Smad成骨信號中起著重要調(diào)控作用。

3.1.1.7表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一種可刺激表皮和其他多種細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)。EGF增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)早期和晚期成骨標(biāo)記物表達(dá)，但被EGF受體抑制劑吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)及酪氨酸激酶受體抑制劑AG-1478、 AG-494顯著抑制；干細(xì)胞移植研究發(fā)現(xiàn)EGF可有效增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的異位成骨； EGF發(fā)揮上述作用也是通過調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的Smad信號通路實現(xiàn)的[19]。

3.1.1.8富含半胱氨酸的表皮生長因子樣蛋白2(cysteine-rich with EGF-like domains protein 2，Creld2) Creld2是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)因子。全基因組表達(dá)譜分析表明Creld2是BMP9刺激MSCs成骨分化中上調(diào)最明顯的基因之一； Smad1/5/8以依賴BMP9的方式直接結(jié)合Creld2 增強(qiáng)子； 外源性表達(dá)Creld2增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)早期和晚期成骨標(biāo)記物表達(dá)、基質(zhì)礦化及異位成骨； 沉默Creld2基因則出現(xiàn)相反作用。Creld2 可能主要在BMP9介導(dǎo)成骨效應(yīng)的終末期發(fā)揮正調(diào)控作用[20]。

3.1.2負(fù)向調(diào)控因子

3.1.2.1成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2) FGF2可在骨折愈合過程中大量分泌，提示其參與成骨過程。FGF2通過阻斷BMP9誘導(dǎo)的Smad信號，降低依賴Smad的ALK1和ALK2的表達(dá)而抑制成骨，這種效應(yīng)可被外源性表達(dá)ALK1和 ALK2所挽救，提示FGF2是BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨信號中重要抑制因子[21]。

3.1.2.2組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs) HDACs催化組蛋白的去乙?；?，維系組蛋白乙?；c去乙酰化的平衡狀態(tài)。HDACs抑制劑制滴菌素(TSA)可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的早晚期成骨標(biāo)志物表達(dá)和基質(zhì)礦化，擴(kuò)大軟骨板生長，促進(jìn)軟骨內(nèi)骨形成?；贖DACs在MSCs中形成負(fù)反饋信號微調(diào)BMP9成骨信號的事實[22]，可利用HDAC抑制劑作為骨折愈合的新型療法。

3.2BMP9成骨信號的串?dāng)_途徑

3.2.1經(jīng)典Wnt信號通路 Wnt是成骨細(xì)胞分化和骨骼發(fā)育中起關(guān)鍵作用的分泌型蛋白家族。Wnts結(jié)合于卷曲蛋白Frizzled(FRZ)和LRP-5/6共受體從而激活不同的信號通路。Tang等[23]發(fā)現(xiàn)，WNT3a和BMP9能增強(qiáng)彼此在MSCs和MEF中誘導(dǎo)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的能力； Wnt通路拮抗劑FRZB抑制BMP9誘導(dǎo)的ALP活性比分泌型蛋白DKK1的抑制作用更強(qiáng)； FRZB過表達(dá)或敲除β-catenin基因，明顯抑制BMP9誘導(dǎo)的體內(nèi)異位成骨和體外基質(zhì)礦化。基因芯片技術(shù)顯示，BMP9誘導(dǎo)MSCs募集β-catenin和Runx2到骨鈣素的啟動子部位，這可能是成骨信號Wnt與BMP9相互作用的關(guān)鍵連接點，二者之間的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

3.2.2TGF-β1信號通路 TGF-β1信號在骨骼形成、成骨細(xì)胞增殖及骨礦化中起重要作用，可增加骨的強(qiáng)度和柔韌性。低濃度的重組TGF-β1(rhTGF-β1)可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2中ALP、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和I型膠原(collagen type I alpha 2，COL1A2)的表達(dá)及基質(zhì)礦化； 高濃度的rhTGF-β1降低OCN和OPN表達(dá)，而不降低COL1A2的表達(dá)，提示TGF-β1信號在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中具有劑量相關(guān)的雙相調(diào)節(jié)作用[24]。

3.2.3絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路 目前研究發(fā)現(xiàn)，BMP9可磷酸化并激活MAPK主要亞族P38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)表達(dá)。P38抑制組抑制BMP9誘導(dǎo)的ALP活性和鈣鹽沉積，而ERK1/2抑制組表現(xiàn)出完全相反的作用[25]； JNK抑制劑SP600125和siRNA JNK均抑制BMP9成骨轉(zhuǎn)錄因子Rux2表達(dá)[26]。體內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)[27]，抑制p38減少BMP9誘導(dǎo)成骨，形成薄骨小梁、更多軟骨細(xì)胞和大量的間充質(zhì)祖細(xì)胞，而RNAi介導(dǎo)的ERK1/2基因沉默則表現(xiàn)相反，進(jìn)一步說明p38和ERK1/2可通過Smad信號軸在 BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中起相反的調(diào)節(jié)作用。

3.2.4Notch信號通路 Notch是一種跨膜蛋白，其信號在決定細(xì)胞分化和細(xì)胞命運中具有至關(guān)重要的作用。經(jīng)AdBMP9處理后,Notch信號通路配體和受體均有不同程度的上調(diào),其中受體Notch4和配體Jag-1上調(diào)最明顯，提示Notch信號參與BMP9介導(dǎo)的成骨分化,其機(jī)制可能是BMP9誘導(dǎo)Notch信號中配體和受體上調(diào)，使Hey1表達(dá)升高而協(xié)同成骨[28]。

3.2.5生長激素(GH)/ JAK/STAT/IGF1途徑 Huang等[29]發(fā)現(xiàn)GH是BMP9過表達(dá)時上調(diào)最明顯的基因之一，基因芯片技術(shù)證實GH是BMP9/Smad途徑直接靶點。外源性表達(dá)GH協(xié)同BMP9早、晚期成骨作用，而被JAK/ STAT通路抑制劑明顯抑制，且IGF1的表達(dá)也被抑制，提示GH可作為BMP9信號的直接靶點，與BMP9協(xié)同激活JAK/STAT/IGF1信號通路，有效地促進(jìn)骨形成。

3.2.6胰島素生長因子2 (IGF-2)/PI3K/AKT信號軸 IGF-2是一種單鏈多肽分子，在胚胎形成和發(fā)育中起重要作用。外源性IGF-2表達(dá)可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的ALP、OPN和OCN活性，促進(jìn)BMP9介導(dǎo)的骨成型蛋白受體-Smad表達(dá)及異位成骨； 而PI3K抑制劑LY294002則通過減弱IGF-2活性抑制BMP9成骨，說明BMP9信號通路可與PI3K/AKT信號中IGF-2耦聯(lián)，共同調(diào)節(jié)MSCs成骨分化[30]。

3.2.7類維生素A(RAs)信號通路 在MSCs中，全反式維甲酸(ATRA)和9 順式維甲酸(9cRA)顯著誘導(dǎo)ALP、OPN和OCN表達(dá)并增加基質(zhì)礦化，AdBMP9過表達(dá)可協(xié)同上述作用； 體內(nèi)干細(xì)胞移植實驗發(fā)現(xiàn)，類維生素A受體a與BMP9在誘導(dǎo)骨小梁和骨樣基質(zhì)產(chǎn)生中也具協(xié)同作用。由此推斷，類維生素A信號能有效增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)成骨分化作用[31]。

3.2.8CXCL12/CXCR4信號軸 趨化因子CXCL12可以在許多組織中表達(dá)，對淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用，CXCR4是其受體。Liu等[32]最近發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的CXCL12/CXCR4預(yù)處理C3H10T1/2細(xì)胞后，通過激活MAPK-Smad信號通路明顯增強(qiáng)早、中期成骨標(biāo)志物ALP、骨鈣素，轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix(OSX)、早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白(PLZF)和DLX5的表達(dá)，而不會影響后期的成骨細(xì)胞標(biāo)記物及鈣沉積的變化。CXCL12/CXCR4信號軸可能是BMP9誘導(dǎo)成骨分化的一個先決條件，在早、中期成骨分化過程中起協(xié)同作用。

4 結(jié)論及展望

BMP9作為目前BMPs家族中成骨能力最強(qiáng)的蛋白，動物實驗證明它在修復(fù)骨缺損和促進(jìn)脊柱融合方面具有良好的臨床應(yīng)用前景； 其不被BMP3及Noggin所抑制，提示BMP9有特殊的成骨機(jī)制。但BMP9成骨信號調(diào)控和串?dāng)_的具體分子機(jī)制及其臨床應(yīng)用的安全性等問題仍有待進(jìn)一步深入研究。

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