苯酚降解菌的分離及其降解特性研究

顏家保，余永登

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430081)

苯酚及其衍生物是一種常見的有毒有機(jī)污染物，且具有致癌性。含苯酚的工業(yè)廢水在直接排放到水體前必須經(jīng)過適當(dāng)處理，否則會對生態(tài)系統(tǒng)造成不可估量的破壞[1-2]。微生物降解方法在苯酚污染治理中起著重要作用，為了強(qiáng)化生物處理效果，可以向生化反應(yīng)池中投加人工篩選出的高效菌，提高目標(biāo)污染物的去除率[3]。目前，運(yùn)用生物降解法降解苯酚的研究文獻(xiàn)較多，研究人員從污染土壤、污水等環(huán)境中分離得到各種各樣的苯酚降解菌[4-9]。筆者從某焦化廠活性污泥中馴化分離得到一株苯酚降解菌，通過革蘭氏染色和一系列生理生化特征實(shí)驗(yàn)對該菌株進(jìn)行初步鑒定，考察多項(xiàng)生長降解條件對其苯酚降解特性的影響，并研究該菌株的苯酚降解動力學(xué)方程，以期為工業(yè)化處理酚類廢水提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

菌種取自武漢鋼鐵集團(tuán)公司某焦化廠曝氣池活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)液體LB培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g酵母浸粉，10 g NaCl，加蒸餾水定容至1000 mL。

(2)微量元素溶液：0.1 g FeSO4，0.1 g ZnSO4，0.01 g KAl(SO4)2，0.01 g NaMo2O4， 0.1 g CoCl2，0.01 g CuSO4，0.01 g H3BO3，加蒸餾水定容至1000 mL。

(3)苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基：1.0 g NaCl，0.1 gCaCl2， 0.5gKH2PO4，0.5gMgSO4·7H2O，0.5 g K2HPO4，1.0 g NH4NO3，2 mL微量元素溶液，加蒸餾水定容至1000 mL，pH值為7.0～7.2。

(4)選擇性固體培養(yǎng)基：在苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基中按20 g/L加入瓊脂，再分別加入一定濃度的苯酚。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚降解菌的富集、分離和純化

在盛有100 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中接種污泥樣本，將培養(yǎng)基在150 r/min、30 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h，取3 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100 mL苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，向其中加入濃度為500 mg/L的苯酚，在相同條件下培養(yǎng)1～2 d，再從中取3 mL培養(yǎng)液接至新鮮苯酚無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，使苯酚濃度為600 mg/L，在相同條件下培養(yǎng)2～3 d，以梯度濃度方式馴化篩選菌株(苯酚濃度逐步由500 mg/L上升至1200 mg/L)。最后將苯酚濃度為1200 mg/L的培養(yǎng)液稀釋，按照涂布平板法在苯酚無機(jī)鹽平板上涂布，并在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d，挑選清晰的菌落，經(jīng)2～3次平板劃線直至獲得單一菌落，分別考察苯酚在各單一菌落下的降解率，選取其中一株效果最優(yōu)的菌株于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定

通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)，并通過革蘭氏染色和一系列生理生化特征實(shí)驗(yàn)對經(jīng)分離純化得到的菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 苯酚降解實(shí)驗(yàn)

將菌株加入盛有100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行苯酚降解實(shí)驗(yàn)。改變菌株接種量、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、金屬離子種類等降解條件，考察苯酚降解效果。

1.2.4 苯酚濃度的測定和菌株生長曲線的繪制

按照《水質(zhì) 揮發(fā)酚的測定 4-氨基安替比林分光光度法》(HJ503—2009)測定苯酚濃度。以不加菌種的培養(yǎng)基做空白對照。

將4 ℃保存的菌株加到含苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在一定條件下培養(yǎng)，每隔2 h采用UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)測定培養(yǎng)液在600 nm處吸光度值OD600，以評價細(xì)菌的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與初步鑒定結(jié)果

經(jīng)過馴化篩選等系列實(shí)驗(yàn)挑選出9株單菌，分別將其接種到含苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，測定苯酚濃度，其中有1株單菌的生長情況明顯優(yōu)于其他菌株，命名為P1。

菌株P(guān)1在苯酚無機(jī)鹽平板上置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，長出的菌落外形呈圓形，不透明，為乳白色，表面濕潤黏稠。對P1進(jìn)行革蘭氏染色，呈陽性，通過細(xì)菌鑒定手冊[10]及生理生化特征實(shí)驗(yàn)初步鑒定為微球菌屬(Micrococcussp.)，其部分生理生化特征見表1。

表1菌株P(guān)1的生理生化特征

Table1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofStrainP1

名稱淀粉水解甲基紅糖發(fā)酵吲哚V-P結(jié)果+-++-

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

2.2 菌株P(guān)1苯酚降解特性的影響因素分析

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH值

在37 ℃、170 r/min、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察培養(yǎng)基初始pH值不同時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果，如圖1所示，其中空白組pH值約為7.0。由圖1可見，最適合菌株降解苯酚的培養(yǎng)基初始pH值為7.0，此條件下經(jīng)過24 h，苯酚降解率基本可達(dá)100%。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.0～9.0時，溶液呈中性或弱堿性，這時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果明顯優(yōu)于pH值為5.0時的降解效果，表明菌株P(guān)1對苯酚的降解更適合在中性或弱堿性環(huán)境下進(jìn)行。這是由于在苯酚的降解過程中產(chǎn)生了偏酸性的中間代謝產(chǎn)物鄰苯二酚[11]，使弱酸性培養(yǎng)基進(jìn)一步酸化，抑制了菌株的代謝，而在偏堿性的培養(yǎng)基中，苯酚代謝產(chǎn)生的偏酸性鄰苯二酚恰好使培養(yǎng)基得到了中和。

圖1 不同初始pH值下菌株P(guān)1對苯酚的降解效果

Fig.1Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentpHvalues

2.2.2 培養(yǎng)溫度

在初始pH值為7.0、170 r/min、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察培養(yǎng)溫度不同時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果，如圖2所示，其中空白組培養(yǎng)溫度為30 ℃。由圖2可見，在0～5 h內(nèi)，溫度對P1的降解能力影響不大，但隨著培養(yǎng)時間的延長，不同溫度下P1的降酚能力就有了明顯區(qū)別，且35 ℃時P1對苯酚的降解效果最好。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下菌株P(guān)1對苯酚的降解效果

Fig.2Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferenttemperatures

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速

在35 ℃、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察搖床轉(zhuǎn)速不同時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果，如圖3所示，其中空白組搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min。由圖3可見，0～8 h內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速對菌株的降解效果沒有明顯影響，但隨著時間的延長，可以觀察到150～200 r/min為P1降解苯酚的最佳搖床轉(zhuǎn)速區(qū)間。

圖3 不同搖床轉(zhuǎn)速下菌株P(guān)1對苯酚的降解效果

Fig.3Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentrotationspeeds

2.2.4 接種量

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、苯酚濃度約為500 mg/L的條件下，考察接種量不同時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果，如圖4所示。由圖4可見，培養(yǎng)初期，隨著接種量的增加，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗率增大，苯酚降解率也隨之增大。但過高的接種量會使微生物所分配到的營養(yǎng)物質(zhì)減少，菌株生長代謝活動反而受到抑制。而接種量為1%～5%時，由于菌量較少，菌株平均分配到的營養(yǎng)物質(zhì)較多，因此菌株繁殖速度較快，隨著培養(yǎng)時間的延長，其苯酚降解效果也越來越好，且接種量為3%時的苯酚降解效率又明顯比接種量為1%和5%時要高。綜合考慮，確定最優(yōu)接種量為3%。

圖4 不同接種量下菌株P(guān)1對苯酚的降解效果

Fig.4Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentinoculumsizes

2.2.5 金屬離子

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度約為500 mg/L的條件下，考察培養(yǎng)基中加入不同金屬離子時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果，結(jié)果如圖5所示，其中每種金屬離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.001%，空白組不加金屬離子。由圖5可見，菌株的生長受到金屬離子的明顯抑制，其中重金屬離子Hg2+對菌株的抑制尤為嚴(yán)重。另外，加入Hg2+的培養(yǎng)液中苯酚濃度出現(xiàn)略微升高，這可能是降解過程中生成了某種中間產(chǎn)物，它對指定波長的光也有吸收，而且比苯酚的摩爾吸光系數(shù)更大。

圖5 加入不同金屬離子時菌株P(guān)1對苯酚的降解效果

Fig.5Phenol-degradingeffectofStrainP1withdifferentmetalions

2.3 菌株P(guān)1的生長特性

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度約為500 mg/L的培養(yǎng)條件下，菌株P(guān)1的生長曲線如圖6所示。由圖6可以看出，菌株P(guān)1在培養(yǎng)4 h后開始進(jìn)入生長對數(shù)期，到約10 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。因此10 h是菌株P(guān)1的生長對數(shù)期頂峰，也是降解苯酚的最佳時間。

圖6 菌株P(guān)1的生長曲線及苯酚降解曲線

Fig.6Growthcurveandphenol-degradingcurveofStrainP1

2.4 菌株P(guān)1對苯酚的降解動力學(xué)分析

為了深入探究菌株P(guān)1對苯酚的降解規(guī)律，在不同底物濃度下進(jìn)行P1的苯酚降解動力學(xué)分析，如圖7所示。從圖7可以看出，苯酚初始濃度越低，降解所需時間越短；苯酚初始濃度為500 mg/L時，苯酚完全降解耗費(fèi)的時間為12 h；苯酚初始濃度超過1000 mg/L時，菌體的生長速度以及苯酚的降解速度均非常緩慢。

菌株P(guān)1在12 h內(nèi)可將濃度為500 mg/L的苯酚完全降解，其代謝速率約為43.05 mg/(L·h)，明顯優(yōu)于馬海娟等[12]篩選得到的Nocardiasp.，該菌完全降解600 mg/L的苯酚需要20 h，也優(yōu)于錢奕忠等[13]篩選出的菌種，該菌完全降解470 mg/L的苯酚需要耗費(fèi)78 h。菌株P(guān)1的苯酚耐受濃度可達(dá)1200 mg/L。

圖7 菌株P(guān)1的苯酚降解動力學(xué)曲線Fig.7 Phenol-degrading kinetic curves of Strain P1

Monod方程作為描述單一基質(zhì)限制生長的動力學(xué)方程，其零級、一級反應(yīng)動力學(xué)方程常被用于代謝動力學(xué)表征。將圖7中的曲線用動力學(xué)方程表示，結(jié)果見表2。由表2可見，當(dāng)苯酚濃度為100～500 mg/L時，苯酚的降解過程符合零級反應(yīng)動力學(xué)方程，即dC/dt=-k；當(dāng)苯酚濃度大于500 mg/L時，苯酚的降解過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，即dlnC/dt=-k。

表2 菌株P(guān)1的苯酚降解動力學(xué)方程Table 2 Phenol-degrading kinetic equations of Strain P1

3 結(jié)論

(1)由某焦化廠活性污泥中馴化得到一株能以苯酚為唯一碳源生長的菌株P(guān)1，該菌株好氧，革蘭氏染色呈陽性，初步鑒定為微球菌屬(Micrococcussp.)。

(2)菌株P(guān)1對苯酚生物降解的較優(yōu)條件為：初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量3%。菌株P(guān)1的生長受到一些金屬離子的顯著抑制，因此在用其處理含苯酚廢水時，必須考慮到廢水中的金屬離子對微生物的影響。

(3)當(dāng)苯酚濃度為100～500 mg/L時，P1對苯酚的降解過程符合Monod零級反應(yīng)動力學(xué)模型。

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