水貂生長(zhǎng)激素受體cDNA克隆與序列分析

榮敏，王雷，吳瓊，李一清，徐佳萍，邢秀梅，楊福合

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省省部共建特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130112)

水貂是一種小型珍貴毛皮動(dòng)物，貂皮是高檔裘皮原料，自古就有“裘皮之王”的美稱。對(duì)于水貂養(yǎng)殖業(yè)來說，皮張等級(jí)是直接影響經(jīng)濟(jì)效益的重要因素，而皮張大小是衡量皮張等級(jí)的重要指標(biāo)。提高水貂皮張張幅的因素主要有增大體型、增加營(yíng)養(yǎng)等，所以研究調(diào)控水貂生長(zhǎng)發(fā)育的生長(zhǎng)軸基因有非常重要的意義。生長(zhǎng)軸是指動(dòng)物體內(nèi)從下丘腦—垂體—靶器官的由一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。生長(zhǎng)激素(GH)在動(dòng)物生長(zhǎng)軸中起著十分重要的作用，但是GH作為生物大分子，必須和靶細(xì)胞膜表面受體(GHR)相結(jié)合才能發(fā)揮作用[1]。

GHR基因最早是由Tsushima T等[2，3]1976年在兔肝細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)的，Waters MJ等[4]1979年提純了兔的GHR。目前已經(jīng)成功克隆出了人、兔、大鼠、小鼠、豬、牛、羊等多種動(dòng)物GHR基因[5～7]。人的GHR基因位于第5號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)8.7kb[8]，有10個(gè)外顯子，共編碼638個(gè)氨基酸，外顯子2編碼18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，外顯子3～7編碼246個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域，外顯子8編碼24個(gè)氨基酸的跨膜部分，外顯子9～10編碼350個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域[7]。成熟的人GHR是一個(gè)含有629個(gè)氨基酸殘基的糖基化位點(diǎn)。豬的GHR基因cDNA也編碼638個(gè)氨基酸，長(zhǎng)1 952bp[9]。研究證明，哺乳動(dòng)物的GHR基因cDNA同源性較高[10]，目前，只有北美水貂GHR基因的622bp部分序列報(bào)道。

本研究以哺乳動(dòng)物GHR基因cDNA序列為基礎(chǔ)，克隆出水貂GHR基因的cDNA序列，為研究水貂GHR基因的全序列、功能及水貂生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水貂肝臟

采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所野生生物資源野外觀測(cè)試驗(yàn)站打皮期美國(guó)短毛黑水貂的肝臟。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ExTaq酶、膠回收試劑盒、pMD19-T載體及DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara公司)。

1.3 水貂肝臟RNA提取

按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取完后放入-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中人、大鼠、牛、小鼠、羊、豬的GHR基因cDNA序列，用MEGA 4.1進(jìn)行序列比對(duì)找到同源保守序列，結(jié)合Primer premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，選擇簡(jiǎn)并度最低且分值較高的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

上游引物：5′ACAGTGATGACTCTTGGGTTG3′

下游引物：5′GCATGATTTTGTTCAGTTGGT3′。

cDNA鏈的合成：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。

PCR反應(yīng)體系：ExTaq0.25μL，10×ExTaqbuffer 5μL，MgCl24μL，dNTP Mixture 4μL，cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 33.75μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 70s，30個(gè)循環(huán) ；72℃ 5min。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳并紫外成像。

1.5 PCR產(chǎn)物的純化

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%凝膠電泳，并切膠回收(按照試劑盒操作進(jìn)行)。

1.6 目的片段的測(cè)序鑒定

將PCR純化產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 目的片段生物信息學(xué)分析

在GenBank中進(jìn)行blastn同源比對(duì)。利用MEGA 4.1軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水貂RNA提取

水貂肝臟RNA提取后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，OD260/280在1.8～2.0之間，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可清晰看到18S、28S 2條核糖體RNA條帶，說明提取的RNA未出現(xiàn)明顯降解。結(jié)果如圖1。

圖1 水貂肝臟總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳分析

Fig.11%agarosegelelectrophoresisanalysisofLivertotalRNAfrommink

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1cDNA鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒2步法合成cDNA，在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，條帶呈彌散狀。結(jié)果如圖2所示。

M.DL2 000；1.cDNA

2.2.2目的基因的擴(kuò)增用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增條帶為900bp左右，與設(shè)計(jì)的902bp接近，說明是目的片段。

M.DL2 000；1、2、3.PCR產(chǎn)物 M.DL2 000;1,2,3.PCRproducts

2.3 水貂GHR基因序列的生物信息學(xué)分析

PCR純化產(chǎn)物測(cè)序后，對(duì)序列進(jìn)行檢查并去除兩端的不準(zhǔn)確序列，獲得826bp的水貂GHR mRNA序列，如圖4。

將序列提交到Http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)址進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果該序列與Genbank中雪貂(XM 004811437)的GHR mRNA預(yù)測(cè)序列同源性達(dá)98%；與獾(JN414715.1)的同源性也高達(dá)98%；與浣熊(JN414718.1)、小熊貓(JN414710.1)、新西蘭海狗(JN414716.1)、海象(DQ240686.1)的同源性達(dá)94%；與港海豹(JN414717.1)、黑熊(DQ240683.1)、細(xì)尾獴(JN414712.1)同源性達(dá)93%；與大熊貓(AF395535.1)、家貓(EU448991.1)、狼(NM 001003123.1)、北極狐(EU304325.1)同源性達(dá)92%；與野豬(KC999114.1)同源性達(dá)89%；與山羊(DQ179245.1)同源性達(dá)87%；與梅花鹿(EU381142.1)、水牛(KC415270.1)、綿羊(NM 001009323.2)、牛(JQ711177.1)同源性達(dá)86%。

圖4 水貂GHR基因的核苷酸序列

經(jīng)分析，本研究獲得的826bp水貂GHR基因部分編碼序列A、T、G、C的平均含量分別為：26.51%、21.79%、23.24%、28.45%，A+T(48.31%)

圖5 水貂GHR基因與其他哺乳動(dòng)物同源基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

生長(zhǎng)軸的作用機(jī)制是：下丘腦分泌的生長(zhǎng)激素釋放激素以及生長(zhǎng)抑素雙重作用于垂體，調(diào)節(jié)垂體分泌生長(zhǎng)激素，分泌的生長(zhǎng)激素經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟，與肝臟細(xì)胞膜表面的生長(zhǎng)激素受體結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)的表達(dá)，IGFs通過與靶組織中的類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而此效應(yīng)受與類胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGFR)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGFs的IGF結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)。血液中高濃度的IGFs還可以負(fù)反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉X和垂體，從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素的釋放。在這些生長(zhǎng)因子中，GH-IGF-I作為生長(zhǎng)軸的中心環(huán)節(jié)，在動(dòng)物的生長(zhǎng)調(diào)控中起著重要作用[11～14]。生長(zhǎng)激素受體在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用，它的突變將引起嚴(yán)重的生長(zhǎng)障礙。

本研究根據(jù)已有的哺乳動(dòng)物序列信息比對(duì)找到保守序列，并以其作為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，成功擴(kuò)增出水貂GHR cDNA序列。同源性分析表明，水貂GHR序列與其他哺乳動(dòng)物具有較高的同源性，為進(jìn)一步研究水貂GHR基因的全序列提供基礎(chǔ)。進(jìn)化樹分析，水貂與熊貓歸為一支，然后共同與北極狐歸為一支，牛、羊與梅花鹿反芻動(dòng)物歸為一支，大鼠、小鼠嚙齒類歸為一支，與傳統(tǒng)的物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系基本一致。

水貂作為珍貴的毛皮動(dòng)物，養(yǎng)殖前景非常廣闊，但是水貂的科學(xué)研究卻相對(duì)落后于其他動(dòng)物，本研究也只是對(duì)水貂GHR基因的部分編碼序列進(jìn)行了克隆測(cè)序，為接下來研究全序列及該基因與生產(chǎn)性能的相關(guān)性提供基礎(chǔ)。

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