基于動(dòng)物體內(nèi)指標(biāo)的枇杷果利尿活性物質(zhì)部位及單體篩選研究

羅彭等

摘要： 為研究枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.]果的動(dòng)物體內(nèi)利尿作用，獲得利尿活性物質(zhì)部位和活性單體，闡述枇杷果利尿作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)和研制枇杷果植物藥利尿劑奠定基礎(chǔ)，通過(guò)試劑法提取、系統(tǒng)溶劑萃取制備枇杷果各極性物質(zhì)部位。依據(jù)生物活性跟蹤法，以小鼠體內(nèi)利尿?yàn)榛钚灾笜?biāo)，柱色譜等為分離純化方法，篩選出利尿物質(zhì)部位，并進(jìn)一步追蹤利尿單體。追蹤過(guò)程中通過(guò)先小量摸索、后大量分離制備的策略，解決體內(nèi)給藥劑量過(guò)大的問(wèn)題。通過(guò)波譜法鑒定單體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，枇杷果乙醇提取物的乙酸乙酯萃取段有較顯著的體內(nèi)利尿活性（P<0.05），利尿強(qiáng)度接近氫氯噻嗪而稍弱于呋噻米，利尿作用速度較緩和。從乙酸乙酯萃取段中分離純化獲得一個(gè)利尿活性物質(zhì)，經(jīng)鑒定為熊果酸，利尿作用顯著（P<0.05），利尿強(qiáng)度接近氫氯噻嗪而稍弱于呋噻米，利尿作用速度較緩和。枇杷果藥食兩用，其乙酸乙酯萃取段可有望開(kāi)發(fā)為長(zhǎng)期使用的安全天然利尿藥物。熊果酸是枇杷果利尿作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量可作為該藥材利尿用途方面的質(zhì)量控制指標(biāo)。該研究是直接通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)藥理指標(biāo)篩選活性單體成功的不多案例之一，具有方法學(xué)借鑒價(jià)值。

關(guān)鍵詞：枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.]果；乙酸乙酯部位；熊果酸；利尿；體內(nèi)；生物活性跟蹤法

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.3；R931.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-3986-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.039

Screening of Diuretic Fractions and Active Monomer from Loquat Fruit by Indices in vivo

LUO Peng， REN Sai-sai， LIANG Ning， CHEN Pan， LIAO Peng-ying， PAN Wei-gao

（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract：The study was aimed at investigating the diuretic activity in vivo of loquat fruit extracts， obtaining diuretic fractions and active monomer， demonstrating the diuretic material foundation of loquat fruit，and finally providing a reference for plant diuretic medicine development. The fractions of different polarity were extracted by reagent and system solvent.The diuretic portion and active monomer were screened by column chromatography and bioassay-guided tracing method based the in vivo diuretic activity in mice.Before large scaled separation and purification，the screening was first through small-batch test.The monomer structure was identified by spectrometry.The results showed that ethyl acetate part of ethanol extracts from loquat fruit presented significant diuretic activity in vivo（P<0.05），and the diuretic intensity was similar to that of Hydrochlorothiazide and slightly inferior to that of Furosemide，the diuretic velocity was moderate.A diuretic activity monomer，which showed significant diuretic activity in vivo （P<0.05），with medium diuretic activity intensity and moderate diuretic velocity），was isolated from ethyl acetate extracts and identified as ursolic acid. It indicated that loquat fruit was a medicine-food fruit with high safety，its ethyl acetate extracts had the potential to be developed a safe natural diuretic for long-term use in clinic. Ursolic acid was the diuretic material foundation of loquat fruit， its content in loquat fruit could be used as the quality control index for diuretic usage.This study was one of few successful cases that directly screening the bio-activity monomer by pharmacological index in vivo，and might be a reference in methodology.

Key words：loquat fruit； ethyl acetate extract； ursolic acid； diuretic activity；in vivo； bioassay-guided tracing technique

枇杷（Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.）為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)，是中國(guó)南方特產(chǎn)的常綠果樹(shù)，主要分布于中國(guó)南部及陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南等地[1]。枇杷已在中國(guó)、日本、印度、西班牙、巴西、美國(guó)、澳大利亞、南非等世界各國(guó)進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模種植[2]。中國(guó)是世界上最主要的枇杷生產(chǎn)國(guó)，栽培面積和產(chǎn)量占世界的70%以上[3]。

枇杷果實(shí)除鮮食外，果肉可生產(chǎn)枇杷酒、罐頭、飲料、糖漿劑等，有潤(rùn)肺、止咳、生津的功效[3]。據(jù)報(bào)道，枇杷（包括果、葉）的苦杏仁苷有鎮(zhèn)咳平喘作用[4]，其中的三萜化合物有抗炎抗免疫作用[5]，另外枇杷還有降血糖、抗癌、抗氧化、保肝等作用[1，6]。但現(xiàn)代研究中并無(wú)任何關(guān)于枇杷利尿作用的報(bào)道。

枇杷果在中國(guó)傳統(tǒng)中藥記載中，有潤(rùn)肺止咳（果肉）、消除水腫（果核）等功效[7]，而消除水腫與利尿有密切關(guān)系。筆者前期發(fā)現(xiàn)給動(dòng)物喂食枇杷果肉也具有良好的利尿作用?？紤]到枇杷果核的潛在毒性作用，本研究只使用了其果肉進(jìn)行利尿研究。一方面擬測(cè)定枇杷果利尿活性的作用強(qiáng)度，另一方面擬通過(guò)生物活性跟蹤法，追蹤分離枇杷果中利尿活性成分，探索枇杷果利尿作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藥材：枇杷鮮果購(gòu)自廣西武鳴縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授和朱意麟實(shí)驗(yàn)師作生藥學(xué)鑒定。

對(duì)照藥品：呋噻米（Furosemide）為江西亞邦?lèi)?ài)普森藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，氫氯噻嗪（Hydrochlorothiazide，HCTZ）為山西云鵬制藥有限公司產(chǎn)品。

動(dòng)物：昆明種SPF級(jí)小鼠，（20±2） g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

儀器設(shè)備：AE100型 1/10 000電子分析天平（日本島津公司）；代謝籠；SartoriusBP121S型電子天平（精度0.1 mg）；Bruck Drx-500型核磁儀（Brucker， Zurich，Switzerland）；Finnigan Trace DSQ質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan，San Jose，California，USA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體內(nèi)利尿活性測(cè)定 參照Abdala等[8]的小鼠代謝籠法，并作適當(dāng)修改：所有試驗(yàn)均在同一實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，小鼠飼養(yǎng)條件一致，12 h/12 h的光暗循環(huán)，室溫控制在24 ℃左右，實(shí)驗(yàn)室安靜、通風(fēng)。試驗(yàn)前3 d置同一實(shí)驗(yàn)室觀察飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，各組飼料與飲用水完全相同。小鼠隨機(jī)分組，每組12只（雌雄各半），分別放入代謝籠中。每個(gè)測(cè)定階段均設(shè)樣品組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組。試驗(yàn)前禁食12 h（不禁水），試驗(yàn)時(shí)禁食禁水。輕壓小鼠下腹排盡余尿，各組動(dòng)物灌胃給予不同的藥物，給藥量為20 mL/kg體重?？瞻讓?duì)照組給予等量的蒸餾水；陽(yáng)性對(duì)照組分別給予氫氯噻嗪和呋噻米（25 mg/kg體重給藥，生理鹽水配制，濃度為1.25 mg/mL）；試驗(yàn)組給予枇杷果不同活性物質(zhì)部位（段），因枇杷果各有效成分的含量隨分離階段不同而不同，故按后續(xù)分離純化階段設(shè)定給藥劑量。每日1次。記錄給藥時(shí)間。每小時(shí)用電子天平稱(chēng)量尿液收集器1次，連續(xù)觀察記錄7 h，統(tǒng)計(jì)1 h和7 h總尿量。重復(fù)測(cè)量6次。

1.2.2 生物活性跟蹤 經(jīng)查閱文獻(xiàn)，尚無(wú)理想的體外利尿藥理指標(biāo)可用于生物活性跟蹤，故本試驗(yàn)直接通過(guò)小鼠體內(nèi)利尿藥理作為篩選指標(biāo)。該方法能直接證實(shí)藥物的有效性（比體外指標(biāo)更可靠），但直接進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，經(jīng)口給藥劑量大，雖然分離前期所得各樣品量充足，但后期隨著分離的不斷進(jìn)行，某些樣品總量小，活性追蹤無(wú)法進(jìn)行。為克服這一困難，本試驗(yàn)在分離前期采取小批量藥材摸索條件，全方位獲得各物質(zhì)部位及大柱各流份，進(jìn)行活性篩選；在前期明確活性部位或流份的基礎(chǔ)上，加大藥材量，著重制備活性部位及流份，放棄其他物質(zhì)部位及流份，以獲得足夠的樣品量用于后期跟蹤。

1.2.2.1 小批量摸索階段 利尿物質(zhì)部位的篩選。枇杷果不同萃取部位的制備：枇杷去核果肉2.8 kg，于50 ℃真空干燥后，用95%乙醇滲漉提取至提取液近無(wú)色，負(fù)壓濃縮后得乙醇提取物123.6 g。乙醇提取物用180 mL蒸餾水懸濁，依次用250 mL石油醚（沸程60～90 ℃）、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位浸膏為5.0 g（生藥出膏率0.18%），乙酸乙酯部位浸膏為9.6 g（生藥出膏率0.34%），將剩余的含水溶液在真空中蒸發(fā)，得到殘?jiān)课唤酁?09.4 g（生藥出膏率3.91%）。經(jīng)乙醇滲漉后的藥渣陰干，用水繼續(xù)滲漉提取，回收溶劑后得水提物浸膏226.1 g（生藥出膏率8.08%）。經(jīng)口給藥劑量為10 g/kg（生藥/體重），故取石油醚部位浸膏0.018 g，乙酸乙酯部位浸膏0.034 g，殘?jiān)课唤?.039 g，水提物浸膏0.045 g，分別用0.5 g飼料將其研勻加入20 mL水溶解，制成混懸液。設(shè)定試驗(yàn)組及空白對(duì)照組，將上述浸膏用小鼠代謝籠法測(cè)定體內(nèi)利尿活性，篩選出活性部位。結(jié)果表明乙酸乙酯萃取部位具有顯著的利尿作用（P<0.01）（表1）。

利尿活性流份的篩選：取利尿活性部位乙酸乙酯段9.6 g，經(jīng)硅膠（200 g，200～300目）柱色譜分離，氯仿∶甲醇梯度洗脫（100∶0→50∶1→30∶1→10∶1→5∶1→2∶1→0∶100）（V/V，下同），收集并檢識(shí)合并流份后，分別得到50∶1流份、30∶1流份、10∶1流份和5∶1流份（其他梯度洗脫所得物質(zhì)量極少），各流份干燥后均用來(lái)做藥理試驗(yàn)，灌胃體積為20 mL/kg體重，灌胃量為25 mg/kg體重。得到有效流分為30∶1流份。

1.2.2.2 大批量制備、分離階段 枇杷去核果肉100 kg，重復(fù)上述提取分離過(guò)程，得氯仿∶甲醇=30∶1高活性段（11.08 g）。取上述樣品經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目，柱直徑10 cm）分離，石油醚︰乙酸乙酯梯度洗脫（4∶1→2∶1→1∶1→0∶100），收集并檢識(shí)合并流份后，分別得到4∶1流份、2∶1流份和1∶1流份（其他梯度洗脫所得物質(zhì)量極少），各流份干燥后均用做利尿作用篩選，灌胃劑量為25 mg/kg體重。得到有效流份為石油醚∶乙酸乙酯（4∶1）洗脫出來(lái)的4∶1流份（0.54 g）。將上述有活性的4∶1流份經(jīng)硅膠柱色譜（300～400目，柱直徑2 cm）行石油醚︰乙酸乙酯（4∶1）等梯度洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜（薄層硅膠，柱直徑1 cm）行石油醚∶丙酮（6∶1）等梯度洗脫，獲得含量較高的高純單體成分（41 mg），經(jīng)藥理檢測(cè)為活性物質(zhì)。

純度檢查：用3種不同的展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行TLC檢識(shí)，碘蒸氣顯色，均呈黃色單斑，結(jié)果如下：系統(tǒng)一為石油醚∶乙酸乙酯（2∶1），Rf=0.49；系統(tǒng)二為石油醚∶丙酮（2∶1），Rf=0.60；系統(tǒng)三為氯仿∶甲醇（10∶1），Rf=0.83。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定方法 通過(guò)光譜手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。EI-MS 在Finnigan Trace DSQ質(zhì)譜儀上測(cè)定；13C-NMR、DEPT （125MHz）和1H-NMR （500 MHz） 在Bruck Drx-500核磁儀上測(cè)定（溫度300 K，溶劑C5D5N，TMS作內(nèi)標(biāo)）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖采用軟件SPSS13.0 for Windows 2004 （SPSS Inc.，Chicago， IL，USA）進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組與空白對(duì)照組的差異性通過(guò)Independent Samples T-test進(jìn)行分析，以P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

利尿物質(zhì)部位：由表1可見(jiàn)，用1 h尿量、7 h總尿量作為指標(biāo)，與空白對(duì)照組相比，乙酸乙酯萃取部位具有良好的利尿作用（P<0.05）。從利尿指數(shù)看，乙酸乙酯部位利尿作用（1.347）稍弱于呋噻米（1.411），而接近氫氯噻嗪（1.370）。從利尿急緩度（1 h尿量/7 h尿量）看，與快速利尿藥呋噻米（0.666）相比，乙酸乙酯部位利尿作用（0.415）具有緩釋性特點(diǎn)，作用速度與氫氯噻嗪更相似（0.477）。

利尿流份、單體：由表1可見(jiàn)，用1 h尿量、7 h總尿量作為指標(biāo)，與空白對(duì)照組相比，氯仿∶甲醇（30∶1）洗脫流份、石油醚∶乙酸乙酯（4∶1）洗脫流份、活性單體有顯著利尿作用（P<0.05），其他流份效果不顯著。從利尿指數(shù)看，30∶1流份（1.347）、4∶1流份（1.336）和活性單體（1.358）稍弱于呋噻米（1.411），而接近氫氯噻嗪（1.370）。從利尿急緩度（1 h尿量/7 h尿量）看，30∶1流份（0.527）、4∶1流份（0.520）和活性單體（0.528）利尿作用速度介于快速利尿藥呋噻米（0.666）與氫氯噻嗪（0.477）之間。

利尿物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定：白色粉末，易溶于乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮，不易溶于石油醚，mp：285～291 ℃。EI-MS m/z：456 （M+），438[M-H2O]+，423，410，395，

300，248，233，219，203，189，175，163，147，133，119，105，

95，81，69，57；1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：5.48（1H，s），3.45（1H，t，J=8.0 Hz），2.63（1H，d，J=11.1 Hz），2.10（1H，m），2.30 （1H，m），1.82-2.00（7H，m），1.30-1.64（9H，m），1.11-1.27（7H，m），0.93-1.08（14H，m），0.80-0.87 （4H，m）；13C-NMR（125MHz，C5D5N）δ：179.9，139.3，125.7，78.1，55.8，53.6，48.1，48.1，42.5，40.0，39.5，

39.5，39.4，39.1，37.5，37.3，33.6，31.1，28.8，28.7，28.2，

24.9，23.9，23.6，21.4，18.8，17.6，17.5，16.6，15.7。綜合ESI-MS 、1HNMR、13CNMR數(shù)據(jù)進(jìn)行解譜，并與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)[9]對(duì)比（文獻(xiàn)測(cè)定條件為：CDCl3，600及150 MHz），碳譜和氫譜數(shù)據(jù)吻合，鑒定為熊果酸（Ursolic Acid，C30H48O3），結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

3 小結(jié)與討論

首次證明枇杷果乙醇提取物的乙酸乙酯萃取段具有明顯利尿作用，與氫氯噻嗪接近，雖然弱于強(qiáng)效利尿藥呋噻米，但枇杷果藥食兩用，其提取物用作緩和利尿劑，長(zhǎng)期使用，安全性有保障。

進(jìn)一步通過(guò)活性跟蹤法從乙酸乙酯利尿活性部位中追蹤得到活性利尿單體熊果酸，揭示了枇杷果利尿作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。利尿活性物質(zhì)部位及活性單體的獲得，為枇杷果開(kāi)發(fā)為利尿藥及制定關(guān)于該藥理作用方面的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了基礎(chǔ)。

由表1中可見(jiàn)，隨著追蹤過(guò)程的進(jìn)行（乙酸乙酯部位→氯仿∶甲醇30∶1流份→石油醚∶乙酸乙酯4∶1流份→有效單體），其利尿活性物質(zhì)含量不斷提高，但并沒(méi)有觀察到利尿活性按正比例關(guān)系提高，其原因有待進(jìn)一步研究。

本研究用動(dòng)物體內(nèi)藥理指標(biāo)（代謝籠法）篩選成分，采取“前期小批量全面摸索，摸清有效物質(zhì)部位（或流份）后，后期大批量重點(diǎn)制備分離”的活性跟蹤策略，克服了活性跟蹤中分離純化所得樣品量難以滿足給藥劑量的矛盾，同時(shí)節(jié)約了分離成本，加快了跟蹤進(jìn)程。本研究直接利用動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)篩選得到活性成分，在活性成分篩選領(lǐng)域是為數(shù)不多的成功案例之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沙 娜，梁敬鈺.枇杷葉研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2006，18（1）：6-10.

[2] LIN S Q，SHARPE R H， JANICK J. Loquat： botany and horticulture[J].Hort Rev，1999，23：233-276.

[3] 張 玉，王建清.枇杷的營(yíng)養(yǎng)成分及功能成分的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：602-604.

[4] 趙 靜.枇杷核苦杏仁苷提取、純化及其抗氧化活性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5] 葛金芳.枇杷葉三萜酸的抗炎免疫作用及對(duì)慢性支氣管炎的治療作用與機(jī)制研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2004.

[6] 李 婷，林文津，徐榕青，等.枇杷葉的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2010，29（5）：11-14.

[7] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草.第4卷[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[8] ABDALA S，MART？魱N-HERRERA D，BENJUMEA D， et al. Diuretic activity of some Smilax canariensis fractions[J].J Ethnopharmacol，2012，140（2）： 277-281.

[9] SEEBACHER W，SIMIC N，WEIS R，et al. Complete assignments of 1H and 13C NMR resonances of oleanolic acid， 18a-oleanolic acid， ursolic acid and their 11-oxo derivatives [J].Magn Reson Chem，2003，41（8）：636-638.