基于連接酶—ELISA反應的單核苷酸多態(tài)性分型新方法

崔海忠， 肖 娜， 張永平， 陳大貴， 唐一通, 趙雪紅, 邵金輝

(1. 湖北文理學院醫(yī)學院 棗陽臨床學院, 棗陽 441200； 2. 湖北文理學院醫(yī)學院 分子醫(yī)學重點實驗室, 襄陽 441053)

單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最為常見的一種遺傳多態(tài)性，占現(xiàn)有多態(tài)性的的90%以上。現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道了超過900萬個SNP位點[1]。開展SNP研究對醫(yī)學、法醫(yī)學、藥物開發(fā)與合理用藥、遺傳學、臨床診斷等的發(fā)展均有非常重要的意義[2]。SNP分型檢測工作，已成為當前國際上研究的熱點。近年來，SNP檢測方法和相關儀器的研發(fā)進展很快。目前，有20余種的SNP分型方法，如直接測序，PCR-RFLP[3-4]，PCR-SSCP[5], Real-Time PCR[6-7], TaqMan PCR[8], Allele-Specific Extension[9-10], Pyrosequencing[11-12], Mass Spectrometry[13-14], Ligase Detection Reaction[15-17]等。其中，直接測序法是傳統(tǒng)的序列測定的方法，但是由于檢測靈敏度較低，在對不均一樣本進行突變等位基因測定時具有較大局限性。雖然焦磷酸測序、熒光定量PCR以及質譜等方法具有較高的檢測靈敏度，但是由于這些方法對實驗設備和實驗條件要求很高，因此很少應用于一般實驗條件下的常規(guī)臨床檢測。本研究中建立了一種基于連接酶-ELISA的SNP分型新方法，并以在非小細胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑藥物個體化治療中的生物標記基因表皮生長因子受體(EGFR)為檢測對象，對有較高突變頻率的EGFR基因外顯子21和18的EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個SNP位點進行了檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

質粒模板：攜帶有野生型和突變型等位基因的EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個SNP位點的質粒DNA。以黃杰[18]定點突變技術進行構建。

圖1 檢測探針設計示意圖。“H1”, “H2”, “Tag1”, “Tag2”代表探針的不同組成部分。

寡核苷酸檢測探針：探針設計方法如圖1所示，利用3條寡核苷酸探針對每個SNP位點進行檢測。3條探針分別為上游的兩條特異性檢測探針和下游的一條公用探針，兩條特異性探針的5′端序列為一段通用擴增引物序列Tag1，3′端序列與模板上SNP位點一側的序列互補，且3′端最后一個堿基與突變位點所在堿基對應互補，與野生型等位基因互補的為野生型檢測探針(Wild Type-Probe)，與突變型等位基因互補的為突變型檢測探針(Mutation Type-Probe)，且特異性探針的5′端進行生物素修飾。公用探針的5′端序列與SNP位點另一側序列互補，3′端序列為一段通用擴增引物序列Tag2。 對EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個SNP位點進行檢測的探針序列如表1所示。

表1 寡核苷酸檢測探針序列

實驗試劑：2×PCR Mastermix購自天根生化科技北京有限公司，Low MW DNA Marker-A購自生工生物工程(上海)有限公司，TaqDNA ligase購自New England BioLabs，辣根過氧化物酶標記兔抗地高辛抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，Streptavidin 磁珠購自西安金磁納米生物技術有限公司。TaKaRaExTaq酶、TA 克隆試劑盒為寶生物工程( 大連) 有限公司產(chǎn)品。所有核酸序列均合成自上海生工生物有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 連接和擴增反應

連接反應：每個SNP檢測位點對應兩個反應管，分別標記為WT、MT，分別加入5 fmol 的重組質粒DNA模板序列、1 U的Taqligase和3 μL 10×連接反應緩沖液，WT管中對應加入50 fmol野生型特異性檢測探針和公用檢測探針，MT管中加入50 fmol突變型特異性檢測探針和公用檢測探針，去離子水補足30 μL。針對每個檢測位點設定一對照管CT，對照管不加入模板序列，其它成分與檢測管相同。連接反應條件為：94℃ 40 s，55℃ 5 min；5 cycles；95℃ 5 min。

通用擴增反應：取2×PCR Mastermix 15 μL，各管連接反應產(chǎn)物2 μL，2 μM的通用擴增引物Tag1 和CTag2，去離子水補足30 μL。95℃ 30 s；95℃ 25 s，60℃ 45 s，72℃ 20 s；20 cycles, 72℃ 1 min進行擴增反應。

1.2.2 擴增產(chǎn)物檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測：分別取各SNP位點對應WT管和MT管擴增產(chǎn)物5 μL進行3.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)WT管和MT管對應泳道在目標位置電泳條帶出現(xiàn)情況判定SNP位點基因型。如果只有WT管對應泳道出現(xiàn)條帶，則該SNP位點為純合野生型；如果WT管和MT管對應泳道均出現(xiàn)條帶，則該SNP位點為野生/突變型；如果只有MT管對應泳道出現(xiàn)條帶，則檢測SNP為純合突變型。

圖2 連接酶-ELISA分型方法檢測流程圖?！啊?表示生物素標記；

ELISA檢測：將擴增產(chǎn)物移入96孔板對應孔中，按照試劑盒操作說明，用鏈親和素磁性微粒對各SNP位點對應各管擴增產(chǎn)物進行純化。并用PBST清洗緩沖液清洗3次磁性微粒，地高辛標記的擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后通過生物素結合至鏈親和素磁性微粒表面，將磁性微粒保存于20 μL 保存緩沖液(10 mM Tris-HCl, pH值7.5)中。各反應孔中加入50 μL辣根過氧化物酶標記抗地高辛抗體溶液(20%胎牛血清1∶1000 稀釋)，室溫恒溫搖床中70 r/min反應30 min。磁性分離并用150 μL清洗緩沖液(1×PBST)清洗3次。加入100 μL的TMB底物緩沖液，25℃顯色 5 min。2 M H2SO4終止顯色反應，設定檢測波長450 nm，背景波長595 nm，酶標儀(ELX 800 UV, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC)測定各孔吸光度值。根據(jù)各SNP位點WT管和MT管對應各孔顯色值判定所檢測SNP位點基因型，判定結果同瓊脂糖凝膠電泳方法。

2 結果

2.1 檢測方法流程

圖2所示為對SNP(T/G)位點的野生純合子進行檢測的示意圖，在連接反應時，只有WT管中的特異性檢測探針和公用探針能完成連接，而MT管中特異性探針和公用探針不能連接，經(jīng)通用引物Tag1 和CTag2的通用擴增和標記，可分別在瓊脂糖凝膠電泳水平和ELISA水平進行分型檢測，檢測結果可通過觀察WT管和MT管對應電泳泳道條帶的出現(xiàn)和顯色孔顯色值來判定。如示意圖中，只在WT管對應泳道出現(xiàn)條帶，而MT管對應泳道無條帶；同理，只在WT管對應顯色孔有顯色值，而MT管對應泳道無顯色值。

2.2 特異性檢測

以擴增反應中的循環(huán)數(shù)對本方法的特異性進行評估，分別對L861Q 和G719C兩個野生型等位基因模板和L858R野生/突變混合模板進行檢測。分別擴增18 和28個循環(huán)，將5 μL各擴增產(chǎn)物做3.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖3所示。在兩個循環(huán)條件下，L858R位點的WT和MT管對應泳道均出現(xiàn)明顯擴增條帶，L861Q 和G719C兩個位點只在WT管對應泳道出現(xiàn)擴增條帶，而MT泳道未有條帶擴增。同時3個位點CT管對應泳道均未出現(xiàn)擴增條帶。說明此方法具有較高的擴增容量和檢測特異性。

圖3 連接酶-ELISA分型方法特異性檢測

2.3 靈敏度檢測

選取L858R位點為檢測對象，突變等位基因在總檢測模板中所占比例分別設定為50%、25%、10%和5%。對不同比例的突變型等位基因進行檢測。

圖 4 L858R位點瓊脂糖凝膠電泳水平敏感度檢測(突變等位基因在總檢測質粒模板中所占比例分別設定為50%, 25%, 10%, 5%)

Fig 4 Sensitivity for the detection of L858R performed with 3.5% agarose gel electrophoresis (The proportions of mutated alleles in the total plasmid DNA were 50%, 25%, 10%, 5%)

結果如圖4所示，在MT和WT管對應的泳道中均檢測出條帶，且隨著突變型等位基因含量的減少，MT管對應條帶逐漸減弱。當?shù)椭?%時條帶較為模糊。為了提高方法的靈敏度，將ELISA方法引入實驗體系中，結果如表2所示。L858R, L861Q 和 G719C位點對應WT管的450 nm處的光吸收值在1.68和1.89之間，MT管的450 nm處的光吸收值在0.71和1.86之間。L858R, L861Q和G719C 3個位點MT管在突變等位基因比例為5%時的光吸收值分別達到0.81、0.71 和0.76。而且，WT和MT管對應光吸收與CT管對應光吸收值的比值均大于5。因此，ELISA水平的檢測有著較高的靈敏度，能夠準確的將5%的突變等位基因從混合模板中檢測出來，尤其適合于從不均一的樣本中進行突變等位基因的檢測。

表2 L858R、L861Q和G719C位點ELISA水平敏感度檢測(突變等位基因在總檢測質粒模板中所占比例分別設定為50%, 25%, 10%, 5%，各檢測值為三次檢測平均值± S.E)

Table 2 Sensitivity for the detection of L858R、L861Q and G719C in exon21 and 18 of EGFR with the ELISA (The proportion of mutated allele in the total plasmid DNA was 50%, 25%, 10%, 5% respectively, values of each reaction tube are means ± S.E. obtained from three independent experiments)

突變等位基因在總檢測質粒模板中所占的比例50%25%10%5%WTL858R1.76±0.111.81±0.151.78±0.171.82±0.14G719C1.82±0.131.79±0.121.86±0.091.78±0.18L861Q1.83±0.161.68±0.211.89±0.111.79±0.08MTL858R1.85±0.091.44±0.161.01±0.180.81±0.09G719C1.72±0.121.68±0.111.09±0.20.76±0.2L861Q1.86±0.141.12±0.130.95±0.130.71±0.05CTL858R0.15±0.020.13±0.030.14±0.020.09±0.02G719C0.12±0.030.09±0.060.11±0.050.07±0.04L861Q0.14±0.020.07±0.070.08±0.040.08±0.02

3 討論

隨著人類基因組計劃的完成，使得生物信息學資源獲得了爆炸性的積累，也極大地推動了SNP突變檢測技術的發(fā)展。但是，雖然在許多技術上取得了進展，SNP檢測技術在實驗成本、常規(guī)性和靈敏度等方面仍需要改進。由于傳統(tǒng)的測序方法檢測靈敏度只有20%[19-20]，不適合對不均一樣本進行突變檢測，雖然焦磷酸測序、定量PCR、質譜等方法的檢測靈敏度較高，可分別達到5%和1%[20-21]，但是這些方法都要求昂貴的實驗試劑和檢測設備，不利于在常規(guī)實驗條件下進行檢測。

本研究中，建立了一種具有較高檢測靈敏度適合于對不均一樣本進行SNP突變檢測而且能夠在一般實驗條件下進行常規(guī)突變檢測的新方法：連接酶-凝膠-ELISA SNP分型方法。本方法基于連接酶反應的原理，通過連接和擴增反應，利用瓊脂糖凝膠電泳和ELISA檢測手段進行SNP位點的分型檢測。與其它檢測方法如測序、熒光定量PCR反應和質譜檢測等相比，本方法操作簡單，不需要昂貴的試劑和實驗儀器，只需借助PCR儀、凝膠電泳和酶標儀等簡單實驗條件下就能完成。

本方法具有較高的特異性和靈敏度。其特異性通過以下條件保證：1)高保真性Taqligase的識別能力；2)檢測探針的設計方法，除依靠WT和MT探針3′端堿基與突變堿基的配對識別能力外，還在其3′端上游第3個堿基處引入一個錯配堿基增強探針的識別能力；3)WT、MT探針和公用探針進行連接反應的H1和H2序列的Tm值與進行通用擴增反應的Tag1和Tag2序列的Tm值相差7～8℃，以減少探針的連接反應和后續(xù)的擴增反應之間的影響。而本方法較高的檢測靈敏度則是通過在探針序列上設計通用擴增序列Tag1和Tag2，完成連接酶反應后，在瓊脂糖凝膠電泳水平檢測時，進行了連接產(chǎn)物的二次擴增反應以增加檢測量；在ELISA水平檢測時，完成二次擴增產(chǎn)物的固相純化后，利用顯色反應進行檢測。

總之，本研究建立了一種SNP分型新方法，并對與酪氨酸激酶抑制劑用藥密切相關的表皮生長因子基因EGFR中的3個常見SNP位點進行了檢測。與現(xiàn)有方法相比，該方法具有較高檢測特異性和靈敏度，適合于在一般實驗條件下對不均一樣本進行常規(guī)SNP分型檢測。但本方法不能對未知SNP位點進行突變檢測，在檢測通量上有一定的局限，適合于進行中低通量的檢測，而不利于進行高通量的突變檢測。

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