嗜冷黃桿菌?；?Acp去飽和酶(AAD)的序列分析和結(jié)構(gòu)建模

張 遠, 茆燦泉

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 成都 610031)

不飽和脂肪酸是生物膜的重要組成成分，同時也是生物體內(nèi)信號傳遞、能量儲備的前體物質(zhì)，對于維持生物體的正常運行起到不可替代的作用。脂肪酸去飽和酶可以催化生物體內(nèi)飽和脂肪酸的去飽和，根據(jù)作用底物的不同可以分為3類：分別為?；d體蛋白去飽和酶、酰基-脂去飽和酶和酰基輔酶A去飽和酶[1]。酰基-Acp(?；d體蛋白)去飽和酶(acyl-acyl carry protein desaturase, AAD)催化飽和脂肪酸鏈9和10位碳原子間碳碳單鍵形成雙鍵，催化形成單不飽和鍵的脂肪酸是多不飽和脂肪酸的前體物質(zhì)，很大程度上決定了多不飽和脂肪酸在生物體內(nèi)的相對含量，從而影響整個生物體的生命狀態(tài)。

細胞膜中膜脂的含量決定著細胞膜的流動性，低溫條件下，多數(shù)微生物通過改變膜脂中的多不飽和脂肪酸含量來維持細胞膜的流動性。Weinstein[2]等研究表明，低溫條件下培養(yǎng)部分真菌菌株，其細胞膜中多不飽和脂肪酸(PUFAs) 的含量會增加，其中長孢被孢霉(mortierellaelongata)會合成十八碳四烯酸，后者主要存在于低溫環(huán)境下的微生物中。Wada[3]利用點突變使藍細菌Δ12-脂肪酸脫氫酶失活，改變了細胞膜磷脂組成，使細胞在22℃培養(yǎng)時生長明顯減慢，進一步把藍細菌的Δ12-脂肪酸脫氫酶基因?qū)氲綄Φ蜏孛舾械乃{細菌中表達，結(jié)果該藍細菌中亞油酸含量明顯增加，對5℃低溫的抗性明顯增強，進一步證明了脂肪酸去飽和酶在維持細菌低溫耐受的關(guān)鍵作用。陸合[4]等通過低溫脅迫根霉R31.6，發(fā)現(xiàn)其抵抗低溫脅迫的主要機制是通過增加膜上不飽和脂肪酸的含量，以此來保證低溫下膜的流動性。于愛群[5]等研究低溫對于高山被孢霉的3種脂肪酸脫氫酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對于高山被孢霉的3種脂肪酸脫氫酶的基因有轉(zhuǎn)錄激活作用。

嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)是一種在低溫環(huán)境下生存的極端環(huán)境微生物，其溫度生長范圍在4℃～25℃，最適生長溫度在21℃。不飽和脂肪酸的相對含量對于細胞膜的流動性起到重要作用，而AAD又是多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，因此AAD在低溫環(huán)境下的活性狀況對于嗜冷黃桿菌的新陳代謝將非常關(guān)鍵。雖有不同物種脂肪酸去飽和酶研究的多個報道[6]，但對于嗜冷黃桿菌的脂肪酸去飽和酶的三維結(jié)構(gòu)解析以及蛋白序列結(jié)構(gòu)中的活性位點分析卻未見報道。本研究利用生物信息學(xué)的技術(shù)與方法對嗜冷黃桿菌AAD的序列組成與理化特性、跨膜和功能結(jié)構(gòu)區(qū)、系統(tǒng)發(fā)育、保守基序、三維結(jié)構(gòu)特征和活性位點等進行分析，為后續(xù)深入研究細菌耐低溫機制及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

嗜冷黃桿菌AAD序列來自于NCBI中protein數(shù)據(jù)庫(登錄號：YP_001294991.1)，模板序列來自于PDB數(shù)據(jù)庫(登錄號：1oq9)，用于系統(tǒng)發(fā)育及保守基序分析的序列均來自于NCBI中protein數(shù)據(jù)庫。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、Protscal(http://web.expasy.org/protscale/)、PSORT(http://psort.hgc.jp/)、Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、Interproscan 4(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對目標(biāo)蛋白序列AAD進行氨基酸序列分析；應(yīng)用ClustalX軟件進行蛋白序列的多序列比對，MEGA4.1構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹；利用weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析不同物種中脂酰去飽和酶的保守基序；AAD的三維結(jié)構(gòu)由swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模完成，使用procheck、Verify 3D(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)對構(gòu)建的模型進行評價；Swiss-Pdb Viewer用于顯示和分析三維結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列分析

Expasy ProtParam tool分析顯示，嗜冷黃桿菌AAD序列全長329個氨基酸，理論等電點pI=5.08,分子量38.42 kD，含酸性氨基酸asp和glu共51個，堿性氨基酸arg和lys共38個，為偏酸性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。Protscal分析表明AAD為親水性蛋白[7]。PSORT分析AAD定位于細胞質(zhì)中，這與Tmpred分析的AAD為非跨膜結(jié)構(gòu)蛋白一致。Interproscan 4分析AAD表明其具備功能delt9-acylAcp-des區(qū)以及Fe離子結(jié)合區(qū)，推斷AAD合成后直接在細胞質(zhì)中與Fe離子結(jié)合形成反應(yīng)復(fù)合物，催化9與10位上的碳碳單鍵形成雙鍵。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索出不同物種的AAD蛋白序列24個，分別為黃桿菌屬(Flavobacteriumfrigoris,WP_007136780.1)、黃桿菌屬(FlavobacteriumpsychrophilumJIP02/86,YP_001294991.1)、鮑氏不動桿菌屬(AcinetobacterbaumanniiOIFC111,EKP44864.1)、互生平胞桿菌(Alteromonasmacleodiistr. ′BlackSea11′,YP_006826131.1)、淀粉絲菌(Amylomycesrouxii,AAB82294.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,AEE27937.1)、PolysphondyliumpallidumPN500 (PolysphondyliumpallidumPN500,EFA75230.1)、CapsasporaowczarzakiATCC 30864 (XP_004364396.1)、網(wǎng)柱菌 (DictyosteliumdiscoideumAX4,XP_636528.1)、播娘蒿屬(Descurainiasophia,ABS86965.1) 、弗朗西斯菌屬(Francisellacf.novicida3523,YP_005824683.1)、伽瑪變形菌屬(gammaproteobacteriumIMCC3088,WP_009574453.1)、柯柯豆毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae,ABQ00180.1)、被孢霉菌(Mortierellaalpina, ADE06659.1)、 亞硝化螺菌屬(Nitrosospirasp.APG3,CCU63342.1)、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus,ACQ73330.1)、核腔菌屬(Pyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFP,EDU49212.1)、蓖麻(Ricinuscommunis,EEF44805.1)、薔薇屬(Rosahybridcultivar,BAA23136.1)、管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis,AEB96387.1)、土拉熱弗朗西斯菌(Francisellatularensissubsp.tularensisTI0902,YP_005317387.1)、梭孢殼屬(ThielaviaterrestrisNRRL8126,AEO66985.1)、油桐屬(Verniciafordii,ADC80920.1)、unculturedmarinegroupIIeuryarchaeote(EHR76326.1)。

圖1 不同物種中脂酰去飽和酶的系統(tǒng)進化樹

由圖1分析可見，此系統(tǒng)發(fā)育樹分為5個分支[8]，嗜冷菌F.frigoris、F.psychrophilumJIP02/86和細菌Nitrosospirasp.APG3同源關(guān)系較近并聚為一個分支A、B為植物類分支，C為細菌類分支，D為真菌類分支，E為動物類分支，其中與C類分支較近的unculturedmarinegroupIIeuryarchaeote為古細菌。

2.3 保守基序分析

利用weblogo分析不同物種中AAD的一致或相似區(qū)[9]。weblogo是將多序列比對的結(jié)果以一種比較直觀的方式表現(xiàn)出來的軟件，如圖2所示，字母越大表示此位點該氨基酸一致性越高；反之一致性越低，保守性也越差。從圖2可以看出，His102、His107和his139、his142、his143以及his303、his306、his307組成HxxxxH、HxxHH、HxxHH(圖2箭頭表示)3個組氨酸保守區(qū)，這3個區(qū)域是鐵離子結(jié)合區(qū)，8個組氨酸任何一個的突變都可能導(dǎo)致整個蛋白酶失去活性[10]。

圖2 不同物種中脂酰去飽和酶的保守基序分析

圖3 SAD與AAD的序列比對及二級結(jié)構(gòu)分布

三角符號表示與二鐵離子相互作用的活性位點區(qū)。

2.4 分子建模

將AAD蛋白序列在NCBI中進行BLAST分析，結(jié)果顯示，在所有的三維結(jié)構(gòu)中，嗜冷黃桿菌AAD與蓖麻子硬脂酰-ACP去飽和酶(Stearoyl Acyl Carrier Protein Desaturase, SAD)的同源一致性為49%，序列覆蓋為96%，而且與SAD與AAD的分子進化關(guān)系較近，因此選定蓖麻子SAD作為同源建模模板。其與嗜冷黃桿菌AAD的序列比對結(jié)果見圖3。利用swiss-model[11]進行同源模建得到嗜冷黃桿菌AAD的三維結(jié)構(gòu)，其三維結(jié)構(gòu)含18個ɑ-螺旋，2個β-折疊。SAD與同源建模得到的AAD三維結(jié)構(gòu)重疊如圖4所示，二者呈現(xiàn)較高的相似性，其重疊的均方根偏差(RMSD)為1.5 ?。

圖4 SAD與AAD三維結(jié)構(gòu)重疊

2.5 分子建模評估

采用PROCHECK和Verify 3D對建立的嗜冷黃桿菌AAD三維結(jié)構(gòu)模型進行評估。PEOCHECK通過分析殘基與殘基間的幾何結(jié)構(gòu)以及整體的幾何結(jié)構(gòu)來評估蛋白結(jié)構(gòu)的立體質(zhì)量，Verify 3D依據(jù)原子模型所處的位置和環(huán)境(α-螺旋，β-折疊，無規(guī)則卷曲，極性，非極性等)以及與適當(dāng)結(jié)構(gòu)的比較從而決定原子模型與自身的氨基酸序列的兼容性。PEOCHECK得到的拉式圖(見圖5)里所示，99.3%的氨基酸的結(jié)構(gòu)處于合理區(qū)，僅有0.7%的氨基酸位于合理區(qū)外，說明同源建模得到的AAD三維結(jié)構(gòu)模型立體幾何結(jié)構(gòu)較為合理。同樣地，通過Verify 3D評價[12]，超過80%的氨基酸評分大于0，也證明了同源建模得到的AAD結(jié)構(gòu)模型其三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象的合理性評價良好。

圖 5 AAD三維結(jié)構(gòu)模型的評估

Fig 5 Evaluation of the three-dimensional structure model of AAD

A—AAD三維結(jié)構(gòu)模型的拉氏圖，其中“A, B, L”為核心區(qū)，“a, b, l, p”為允許區(qū)，“～a, ～b, ～l, ～p”為額外接受區(qū)域，空白區(qū)為不合理區(qū)域；B—AAD三維結(jié)構(gòu)模型的Verify-3D圖，分值大于0的為合理構(gòu)象。

2.6 活性位點分析

將AAD與SAD三維結(jié)構(gòu)重疊，從AAD上找到了與SAD一致的活性位點，主要有His114、Glu111、Glu76、His200、Glu197、Glu164，與SAD上面的活性位點高度保守(圖3)，其中包含兩個螯合鐵離子Fe1、Fe2，F(xiàn)e1與His114 、Glu111 、Glu76相互作用[13]，F(xiàn)e2與His200、Glu197、Glu164作用。鐵離子對于維持整個蛋白活性起到重要作用，鐵離子的缺失將會造成活性位點碳側(cè)鏈的構(gòu)象紊亂，從而導(dǎo)致AAD活性喪失。

圖6 活性位點與鐵離子的相互作用及立體構(gòu)象

3 討論

微生物在低溫條件下的耐受與活性機制一直都是嗜冷微生物研究的熱點，不飽和脂肪酸對于低溫情況下維持微生物細胞的流動性起到非常重要的作用。本研究以低溫微生物嗜冷黃桿菌中與多不飽和脂肪酸代謝重要相關(guān)的蛋白AAD為研究對象，就其序列組成與基序特征、系統(tǒng)進化與重要活性位點中心，三維結(jié)構(gòu)模建及評價等展開了廣泛和深入的研究。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的脂肪酸去飽和酶差異很大，嗜冷黃桿菌等低溫耐受菌與常溫細菌之間的AAD分子進化關(guān)系較遠，反而與植物類物種的SAD分子進化關(guān)系較近。之后的保守基序分析表明大多物種的脂肪酸脫氫酶都具備HxxxxH、HxxHH、HxxHH 3個組氨酸保守區(qū)，這與該保守區(qū)能與二鐵離子結(jié)合[14]，對酶的活性產(chǎn)生重要影響。將AAD蛋白序列在NCBI中用BLAST分析，結(jié)果顯示在所有的三維結(jié)構(gòu)中，AAD與SAD的同源一致性為49%，序列覆蓋度為96%，而其它解析結(jié)構(gòu)的序列覆蓋度都不超過50%，而且SAD與AAD的分子進化關(guān)系較近，因此選定蓖麻子SAD作為同源建模模板。之后的三維結(jié)構(gòu)建模及活性位點分析發(fā)現(xiàn)，AAD與SAD的同源一致性非常高，兩者之間的序列比對分析發(fā)現(xiàn)，SAD的二鐵離子結(jié)合區(qū)[13]，在AAD中也同樣存在。結(jié)合嗜冷黃桿菌AAD與常溫細菌的分子進化關(guān)系較遠，而與植物SAD的分子進化關(guān)系較近，并且二鐵離子結(jié)合區(qū)的活性位點更接近于植物SAD的活性位點，可以推測相對于常溫菌而言，低溫菌中的低溫耐受相關(guān)的基因可能發(fā)生了一定的變異。

本實驗室目前已從環(huán)境污水中篩選獲得一株較強低溫耐受性的微小桿菌(Exiguobacteriumsibiricum)并從中克隆和獲得了脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase)基因，而對AAD的生物信息分析發(fā)現(xiàn)，大多物種由His102、His107、His139、His142、His143、His303、His306和His307組成的二鐵離子結(jié)合區(qū)與嗜冷黃桿菌AAD由His114、Glu111、Glu76、His200、Glu197、Glu164組成的二鐵離子結(jié)合區(qū)存在著氨基酸差異，而二鐵離子結(jié)合區(qū)對于脂肪酸去飽和酶的活性影響很大。這為深入開展脂肪酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)改造與功能研究提供了方向，也為了解低溫菌低溫耐受機制奠定了重要的前期工作基礎(chǔ)。

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