小鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備及心肌梗死面積評價方法學比較

孟增慧 楊承志 田愛炬 呂志珍 張幼怡 高煒 李子健 郭麗君

.基礎研究.

小鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備及心肌梗死面積評價方法學比較

孟增慧 楊承志 田愛炬 呂志珍 張幼怡 高煒 李子健 郭麗君

目的 對小鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備及心肌梗死面積評價方法進行比較。方法 40只雄性BAB/c小鼠按完全隨機設計方法分為傳統方法組和改良方法組，傳統方法組的心肌再灌注操作采用再次開胸、松開結扎線的方法，改良方法組的心肌再灌注操作為在體外松開結扎線，無需再次開胸。采用伊文思藍-TTC雙染色方法區(qū)分缺血再灌注損傷后心肌的梗死區(qū)(IA)、缺血危險區(qū)(AAR)和左心室總面積(LV)。同時采用傳統算法和質量權重法計算心肌梗死面積，質量權重法即在傳統算法的基礎上，用切片中各區(qū)域面積乘以該片心肌質量的百分比，累加各切片的相應區(qū)域面積，再計算百分比。結果 無論采用哪種算法，傳統方法組與改良方法組心肌梗死面積(IA/AAR)差異無統計學意義(傳統算法:傳統方法組44.43%±2.28%，改良方法組44.24%±1.68%，P=0.96；質量權重法:傳統方法組51.74%±2.26%，改良方法組54.51%±1.14%，P=0.23)。與傳統方法組相比，改良方法組術后存活率高、麻醉劑使用劑量小、蘇醒時間短(均為P＜0.05)。此外，采用質量權重法計算AAR/LV、IA/AAR數據的標準差顯著小于傳統算法(AAR/LV:傳統算法標準差2.90，質量權重法標準差1.24；IA/AAR:傳統算法標準差2.22，質量權重法標準差:1.00)。結論 與傳統方法相比，改良方法能夠更加穩(wěn)定、有效地制備小鼠心肌缺血再灌注模型。此外，采用質量權重法計算的心肌梗死面積數據比傳統方法準確性更高。

心肌缺血； 再灌注損傷； 小鼠； 模型，動物； 心肌梗死面積

冠心病已成為危害我國居民健康的頭號殺手，2011年我國急性心肌梗死患者住院總費用高達49.9億元［1］。藥物溶栓、介入治療和冠狀動脈旁路移植術等是安全有效和廣泛應用的再灌注方法［2］。然而，這些再灌注的策略在某些情況下也能導致進一步的心肌損傷，被定義為缺血再灌注損傷，發(fā)生率高達25%～30%，其機制尚未完全闡明［3］。因此，建立穩(wěn)定有效的心肌缺血再灌注模型，有助于探索新的治療靶點和防治方法。

小鼠是轉基因動物的最廣泛載體，且成本低、便于飼養(yǎng)繁殖，是制備心肌缺血再灌注模型的理想動物，但其耐創(chuàng)傷能力差、氣胸發(fā)生率高，導致模型制作難度大、成功率低［4］。目前，國內外文獻對再灌注這一步驟主要采用再次開胸、開放結扎線的方法［5］，但該方法對麻醉深度要求高，也增加了肺損傷致死的風險。此外，多數文獻對于再灌注后心肌梗死面積的計算方法表述不詳，所使用的評價計算方法也并不統一。本研究針對以上問題，探討通過對心肌缺血再灌注模型的制備方法(尤其是再灌注步驟的方法)進行改良能否達到簡化操作和提高模型成功率的目的，并對再灌注后心肌梗死面積的計算方法進行比較，旨在發(fā)現更規(guī)范、準確的心肌梗死面積的評價方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性8周齡BAB/c小鼠40只，體質量(28.50±0.16)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，在北京大學醫(yī)學部實驗動物中心SPF級環(huán)境(室溫23℃、相對濕度為65%，12 h明暗交替)飼養(yǎng)至12周開始實驗，采用完全隨機設計方法分為傳統方法和改良方法兩組，每組各20只。

1.2 主要試劑及儀器

1%戊巴比妥鈉溶液，阿托品，小動物呼吸機(Kent scientific，TOPO)，小動物心電圖檢測儀(Softron，SP2006)，體式顯微鏡(Olympus，SZX16)，伊文思藍(Evans blue，sigma)，1%氯化三苯基四氮唑(TTC，sigma)。

1.3 手術方法

1.3.1 麻醉及術前準備 小鼠術前禁食水8 h。稱體重后，使用1%戊巴比妥鈉溶液(0.60 m l/100 g)腹腔注射進行麻醉，如術中麻醉深度不足，則補充起始麻醉劑量的一半。小鼠麻醉后左側胸部脫毛，經口腔氣管插管后，連接小動物呼吸機維持呼吸，氣道壓力峰值14.40 cmH2O，呼吸頻率88次/min，通氣量1 L/min，觀察到小鼠呼吸起伏與呼吸機頻率一致。將小鼠仰臥，四肢固定于循環(huán)加熱手術臺上，連接小動物心電圖檢測儀肢導電極，記錄術中心電變化。

1.3.2 缺血再灌注模型手術操作 手術區(qū)域備皮消毒，于胸骨左側第3、4肋間剪開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，打開胸腔，用開胸器撐開肋間、充分暴露心臟，剪開心包，在體視顯微鏡下仔細辨認，可見在心耳下緣或左側出現一條粉紅色血管即為左冠狀動脈的前降支(LAD)。采用帶線6-0線縫合針于心耳下緣1 mm處穿過心肌表層，待加壓結扎LAD。傳統方法組:結扎前在線下墊0.2～0.3 cm的10號聚乙烯管［6］，結扎LAD后看到左心室前壁心肌變白，局部收縮運動受限，左心耳充盈脹滿，心電圖見ST段持續(xù)弓背抬高，表明心肌缺血成功［7］。簡易縫合關閉胸腔，缺血30 min后再次打開胸腔，取出聚乙烯管，剪開結扎線，可見心臟表面由蒼白變?yōu)榧t色，心電圖ST段抬高部分回落，判斷再灌注成功［7］。待小鼠蘇醒后，拔除氣管插管，將其置于38℃保溫毯上過夜。改良方法組:用兩條長約5 cm的縫線線圈代替?zhèn)鹘y的10號聚乙烯管(圖1A)，隨后結扎LAD，確認心肌缺血后逐層關閉胸腔、縫合皮膚和肌肉，注意將兩條線圈置于切口兩側并留在體外。缺血30 min后，雙手同時緩慢用力，向小鼠身體兩側水平拉動線圈(圖1B)，直至將其完全拉出體外，多數情況下可見一側線圈上黏附心臟結扎線，此時心臟上的結扎線被線圈拉開，心電圖ST段抬高部分回落，判斷再灌注成功。待小鼠蘇醒后，拔除氣管插管，將其置于38℃保溫毯上過夜。

圖1 小鼠心肌缺血再灌注模型制備方法

1.4 心肌梗死面積評價

1.4.1 伊文思藍-TTC染色 再灌注24 h后，再次麻醉小鼠、氣管插管、連接呼吸機、打開胸腔，在缺血時結扎冠狀動脈的位置再次結扎，用1 ml注射器插入心尖，注射1%伊文思藍0.3 m l，將非缺血區(qū)心肌呈藍色，其余心肌即為缺血危險區(qū)。立即摘取心臟，以預冷的PBS緩沖液沖洗殘血，切除結扎線以上的心臟部分，用濾紙蘸干并放置于-20℃冰凍30 min，取出后迅速沿垂直左心室長軸的方向橫切5～6片厚約1 mm的心肌，按順序浸泡于預先37℃溫浴的1%TTC溶液中，并放于37℃溫箱中避光孵育10 min。此時梗死區(qū)被染成灰白色。

1.4.2 心肌梗死面積的計算 將染好的心肌切片放在EPSON掃描儀(V700)上，采用24位真彩，2400 dpi分辨率進行掃描。傳統算法:采用Image-Pro Plus 6.0進行面積統計分析，分別計算左心室面積(全部心肌，LV)、缺血危險區(qū)面積(紅色+白色，AAR)和梗死區(qū)面積(白色，IA)。質量權重法:將心肌切片逐一稱質量，計算每片心肌切片質量占全部心肌切片質量的百分比，在傳統算法操作的基礎上，用各切片中各區(qū)域的面積乘以該片心肌質量的百分比。用AAR/LV評價結扎的位置是否一致，即經歷缺血的缺血危險區(qū)是否相同，用IA/AAR評價心肌梗死的面積。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 模型存活率比較

傳統方法組:再次開胸時，因氣胸死亡1只，肺損傷死亡2只，麻醉深度不足再次補給麻醉劑后不耐受死亡2只，再灌后心律失常死亡1只，存活14只，存活率為70%。改良方法組:再灌后心律失常死亡1只，存活19只，存活率為95%(χ2=4.329，P=0.037)。

2.2 兩種模型制備方法小鼠體質量、麻醉劑劑量及蘇醒時間比較

傳統方法組與改良方法組小鼠體質量差異無統計學意義［(28.30±0.22)g比(28.53±0.22)g，P=0.47］。傳統方法組的平均麻醉劑(起始+補充)用量［(0.23±0.01)m l比(0.17±0.01)m l，P= 0.001］和平均蘇醒時間［(185.50±7.35)min比(129.30±9.12)min，P=0.001］均大于改良方法組。

2.3 兩種模型制備方法心肌缺血和再灌注時心電圖變化的比較

傳統方法組心電圖(圖2A)與改良方法組心電圖(圖2B)均出現缺血期ST段抬高、再灌注期ST段回落，提示缺血再灌注手術模型成功。

圖2 小鼠缺血再灌注手術前、缺血、再灌期心電圖

2.4 兩種模型制備方法心肌梗死面積的比較

如圖3A所示，伊文思藍-TTC染色將非缺血區(qū)染成藍色，缺血非梗死區(qū)染成紅色，心肌梗死區(qū)染成白色。用AAR/LV評價缺血區(qū)面積(即結扎高度)，用IA/AAR評價心肌梗死的面積。無論采用傳統算法(圖3B)還是質量權重法(圖3C)，傳統方法組與改良方法組之間AAR/LV、IA/AAR差異均無統計學意義。以上結果表明改良后的再灌注方法同樣可以保證造模成功。

圖3 小鼠心肌組織伊文思藍-TTC染色及心肌梗死面積計算

2.5 心肌梗死面積的計算方法比較

將傳統方法組與改良方法組共34份心臟切片分別使用傳統算法及質量權重法計算心肌梗死面積。結果顯示兩種計算方法所得數據AAR/LV(傳統算法:56.04%±2.90%比質量權重法:62.68%± 1.24%，P=0.014)和IA/AAR(傳統算法: 47.68%±2.22%比質量權重法:54.34%±1.00%，P=0.011)差異均有統計學意義，且質量權重法計算的數據標準差均低于傳統算法(圖4)。以上結果表明，不同的計算方法獲得的實驗數據存在統計學差異，且質量權重法的數據標準差更小，因此所獲得的數據準確性更高。

圖4 不同算法對心肌梗死面積評價的影響

3 討論

近年來，藥物溶栓、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術等再灌注療法已成為臨床上治療心肌梗死的主要手段［8］，而由此造成的心肌缺血再灌注損傷現象也越來越受到重視，其發(fā)病機制及防治手段已成為亟待解決的研究熱點。心肌缺血再灌注模型的建立，有助于研究疾病發(fā)病機制、病理變化、分子信號通路及藥物療效等。我們對制作難度大、成功率低的小鼠心肌缺血再灌注模型制作方法進行改良，提出了一種更簡便、易操作的再灌注操作技術，并用質量的權重對心肌梗死面積評價方法進行校正，以便更加準確、客觀的評價心肌梗死面積。

從模型存活率來看，傳統的再灌注方法模型制備存活率較低(70%)，術中死亡5只，其中4只于再灌注操作時死亡，這與傳統方法手術中需兩次開胸、關胸造成的損傷有關，小鼠胸壁組織薄弱、耐創(chuàng)傷能力低、氣胸發(fā)生率高，多次縫扎胸壁必然造成對胸壁及肺的額外損傷，降低手術存活率。改良方法中避免了二次開胸操作，模型存活率高達95%，僅有1只因再灌注后心律失常死亡，表明僅需1次關胸的線圈提拉法制作再灌注模型對小鼠造成的損傷更小，存活率更高。此外，相比于需要在麻醉狀態(tài)下進行再灌注的傳統方法(即麻醉狀態(tài)下開胸移除結扎線)，改良的再灌注方法可在小鼠清醒的狀態(tài)下進行操作，降低了小鼠的麻醉時間和麻醉藥物劑量，因此也降低了小鼠對麻醉劑不耐受的概率，所以對于更長的缺血時間方案，改良的再灌注方法更具優(yōu)勢。由于改良的再灌注方法操作簡便、快捷，可保證在極短的時間內完成再灌注，相比于傳統的操作方法，改良方法對于再灌注開始的時間控制更為精確，更有效地確保了實驗的嚴謹性和準確性。同時，無論是從心電圖結果還是經心肌梗死面積評定都證實缺血再灌注模型制備成功，傳統與改良的線圈提拉法制備的模型之間在缺血危險區(qū)和梗死區(qū)面積方面并不存在差異，使我們相信簡便快捷的線圈提拉法小鼠心肌缺血再灌注模型制備技術有望替代先前廣泛應用的傳統方法。

伊文思藍-TTC染色作為公認的評價心肌梗死面積的“金指標”，廣泛應用于幾乎所有涉及心肌梗死再灌注手術的實驗中［9-11］，因此，建立一種準確、規(guī)范的計算心肌缺血梗死面積的方法具有重要的實際應用意義。從評價心肌梗死面積的方法來看，由于每片心肌切片質量相差較大，所以按照傳統的忽略質量權重的計算方法來評價心肌梗死面積，顯然與實際的心肌梗死面積有較大差異，欠缺規(guī)范性和準確性。從統計學數據上來看，將傳統算法與質量權重法的心肌梗死面積進行比較，其差異具有統計學意義，且質量權重法計算所得數據的標準差更小。標準差越小，表明觀察值間的變異性和離散程度低，均數的代表性好，數據的準確程度高。因此，質量權重法計算獲得的數值離散程度更低，變異性小，數據準確性更高，有利于建立更規(guī)范、準確的心肌梗死面積的評價方法。

此外，在手術中還有以下幾點應予以注意，以提高心肌缺血再灌注手術的成功率:(1)阿托品的使用:麻醉劑中應加入阿托品(1 ml/20 ml)，以減少支氣管黏液分泌，降低氣管插管被堵塞的風險；(2)體式顯微鏡的應用:在體式顯微鏡下可清楚觀察到冠狀動脈的走形，以確保準確、有效的結扎冠狀動脈左前降支、控制心肌梗死面積，避免因解剖結構變異造成的實驗誤差；(3)術后處理:小鼠從麻醉中蘇醒后易發(fā)生低體溫，應置于保溫毯上保溫以降低死亡率，且有文獻報道，小鼠體核溫度可以影響心肌缺血損傷［12］，此外，由于小鼠術前禁水8 h，術中尚有額外的血液損失，容易造成小鼠低血容量，因此應注意給予充足水源，術中失血量過大者可酌情給予皮下注射生理鹽水0.2～0.3 ml以維持循環(huán)血量。

綜上所述，本研究結果提示，改良的線圈提拉法可能是一種更簡便易行的小鼠心肌缺血再灌注模型制備手術的替代方法；心肌梗死面積計算方法的不同，可能會導致實驗結果的差異，質量權重梗死面積計算法獲得的數據準確性更高，但該算法對心肌梗死面積評價的優(yōu)勢尚需進一步驗證。

［1］Wang W，Zhu ML，Wang YJ，et al.Cardiovascular disease has become a major public health problem in China—summary of Report on Cardiovascular Disease in China，2011［J］.Chinese Circulation Journal，2012，27:409-411.(in Chinese)王文，朱曼璐，王擁軍，等.心血管病已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題——《中國心血管病報告2011》概要［J］.中國循環(huán)雜志，2012，27:409-411.

［2］Stiermaier T，Desch S，Schuler G，et al.Reperfusion strategies in ST-segment elevation myocardial infarction［J］.Minerva Medica，2013，104:391-411.

［3］Buja LM.Myocardial ischemia and reperfusion injury［J］. Cardiovasc Pathol，2005，14:170-175.

［4］Li JF，Li DK.Recent advances in animal models of myocardial infarction［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2013，29:5-10.(in Chinese)李峰杰，李貽奎.心肌梗死動物模型研究進展［J］.中國藥理學通報，2013，29:5-10.

［5］Li YJ，Cai M，Chen ZS，et al.Research on establishing myocardial ischemia/reperfusion model and TTC staining in mouse［J］.Shandong Medical Journal，2010，50:42-44.(in Chinese)李袁靜，蔡明，陳知水，等.建立小鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型手術技巧及TTC染色方法探討［J］.山東醫(yī)藥，2010，50:42-44.

［6］Hsu CP，Zhai P，Yamamoto T，et al.Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion［J］.Circulation，2010，122:2170-2182.

［7］Preda MB，Burlacu A.Electrocardiography as a tool for validating myocardial ischemia reperfusion procedures in mice［J］.Comp Med，2010，60:443-447.

［8］Harker M，Carville S，Henderson R，et al.Key recommendations and evidence from the NICE guideline for the acute management of ST-segment-elevation myocardial infarction［J］.Heart，2014，100:536-543.

［9］Horstkotte J，Perisic T，Schneider M，et al.Mitochondrial thioredoxin reductase is essential for early postischemic myocardial protection［J］.Circulation，2011，124:2892-2902.

［10］Matsushima S，Kuroda J，Ago T，et al.Broad suppression of NADPH oxidase activity exacerbates ischemia/reperfusion injury through inadvertent downregulation of hypoxia-inducible factor-1α and upregulation of peroxisomeproliferator-activated receptor-α［J］.Circ Res，2013，112:1135-1149.

［11］Wang C，Liu M，Sun S，et al.American Ginseng Leaves Extract attenuates myocardial ischemia reperfusion injury through inhibition of endoplasmic reticulum stress in rats［J］.Chinese Journal Of Pathophysiology，2013，29:20-27.(in Chinese)王琛，劉蜜，孫勝，等.西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內質網應激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷［J］.中國病理生理雜志，2013，29:20-27.

［12］Guo Y，Flaherty MP，Wu WJ，et al.Genetic background，gender，age，body temperature，and arterial blood pH have a major impact on myocardial infarct size in the mouse and need to be carefully measured and/or taken into account:results of a comprehensive analysis of determinants of infarct size in 1，074 mice［J］.Basic Res Cardiol，2012，107:288.

Com parison of methods for establishing mouse m yocardial ischem ia/reperfusion model and assessing myocardial infarct size

Meng Zenghui，Yang Chengzhi，Tian Aiju，Lyu Zhizhen，Zhang Youyi，Gao Wei，Li Zijian，Guo Lijun.
Department of Cardiology，Peking University Third Hospital，Institute of Vascular Medicine，Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides，Ministry of Health，Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences，Ministry of Education and Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research，Beijing 100191，China

Objective The study aims to establish an efficient mouse model of myocardial ischemia/reperfusion and the assessment of myocardial infarct size.M ethods Forty male BAB/c mice were equally divided into the classic method group and the new method group.In the classic method group，reperfusion was achieved by reopening the chest and releasing the ligation，while in the new method group reperfusion was achieved by releasing the slipknot without opening the chest for the second time.Infarct area (IA)，area at risk(AAR)and left ventricular(LV)area was quantitatively evaluated by Evans blue-TTC staining.Two measurements were applied to analyze the data.Compared to the classic measurement，IA，AAR and LV areas on each section were multiplied by the percentage of weight of the section and then totaled from all sections in new measurement.Results The myocardial infarction size(IA/AAR)was not significantly different between classic and new method group(classic measurement:classic method group44.43%±2.28%new method group 44.24%±1.68%，P=0.96；new measurement:classic method group 51.74%±2.26%new method group 54.51%±1.14%，P=0.23).Higher survival rate，less anesthetic dosage and reduced analepsia time were observed in the new method group in comparison with the classic method group(all P＜0.05).In addition，the standard deviation of both AAR/LV and IA/AAR were lower in the new measurement group.Conclusions The new method for establishing myocardial ischemia/ reperfusion mouse model is more efficient compared with the classic method.Furthermore the new measurement is more accurate for the assessment of myocardial infarct size than the classic measurement.

Myocardial ischemia； Reperfusion injury； Mice； Models，animal； Infarct size

Guo Lijun，Email:guo_li_jun@sohu.com

2014-02-21)

(本文編輯:譚瀟)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.012

100191北京大學第三醫(yī)院心內科，血管醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學與調節(jié)肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室

郭麗君，電子信箱:guo_li_jun@sohu.com