結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)與結(jié)核抗體檢測(cè)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核輔助診斷中的價(jià)值

范俊 秦世炳 賈紅彥 潘麗萍 蘭汀隆

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核中最常見的慢性疾病[1]，常常隱匿起病，早期臨床癥狀多不典型，早期診斷與鑒別診斷困難，易被延誤治療。而骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷至關(guān)重要，及時(shí)的早期治療可以減少軀體殘疾和損傷的發(fā)生率[2]。目前，骨關(guān)節(jié)結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，但陽(yáng)性率較低且耗時(shí)長(zhǎng)，組織病理學(xué)診斷標(biāo)本不易獲得而且為有創(chuàng)性，從而使得骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此迫切需要尋找一種新的輔助診斷方法以提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期快速診斷水平。結(jié)核抗體的檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于血清及體液標(biāo)本的檢測(cè)，但敏感度和特異度并不理想[3]。近年來(lái)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)逐漸興起，結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)即為其代表[4]。本研究初步探討T-SPOT.TB和結(jié)核抗體檢測(cè)在早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核中輔助診斷的意義與價(jià)值。

資料和方法

一、 一般資料

選取2011年7月至2013年10月期間，在北京胸科醫(yī)院收治的骨關(guān)節(jié)疾病患者432例，其中男250例，女182例；年齡15～77歲，平均(48±16.7)歲。排除其中診斷不明確的患者39例、無(wú)病理學(xué)或細(xì)菌學(xué)證據(jù)的患者40例和未完成全部檢測(cè)的患者128例，共納入225例患者。所有患者HIV檢測(cè)均為陰性，均無(wú)免疫抑制劑及免疫增強(qiáng)劑使用史。將入選的225例患者分為結(jié)核組和對(duì)照組，均經(jīng)T-SPOT.TB試驗(yàn)檢測(cè)及血清學(xué)結(jié)核分枝桿菌特異性IgG抗體檢測(cè)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)[批件號(hào)：(2011)年KY臨審第(13)號(hào)]，征得受試對(duì)象同意并簽署知情同意書。

1.結(jié)核組入選標(biāo)準(zhǔn)：選擇初治的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，所有患者抗結(jié)核治療均<1周，均行手術(shù)治療，術(shù)后留取膿液送抗酸染色涂片鏡檢及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，并由組織病理學(xué)確認(rèn)結(jié)核病診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及組織病理不能確認(rèn)診斷者；合并其他部位結(jié)核患者。符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者146例，排除標(biāo)準(zhǔn)排除54例，排除原因?yàn)楹喜⒎谓Y(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核等其他部位結(jié)核。最終入組92例，其中男53例，女39例，年齡15～76歲，平均(40.0±15.4)歲。以病理診斷或改良羅氏培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)[5]，其中脊柱結(jié)核65例，髖關(guān)節(jié)結(jié)核8例，膝關(guān)節(jié)結(jié)核6例，肘關(guān)節(jié)結(jié)核5例，肩關(guān)節(jié)結(jié)核5例，腕關(guān)節(jié)結(jié)核2例，胸鎖關(guān)節(jié)結(jié)核1例。

2.對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均行手術(shù)治療，并由病理明確診斷。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及組織病理學(xué)均排除結(jié)核診斷，無(wú)其他部位結(jié)核和結(jié)核病接觸史。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理診斷不清楚及不能完成隨診。非結(jié)核骨關(guān)節(jié)疾病患者79例，按排除標(biāo)準(zhǔn)排除15例，排除原因?yàn)椴荒芡瓿呻S診。最終入組共64例，其中男35例，女29例，年齡16～77歲，平均年齡(43.3±17.8)歲。對(duì)照組患者包括脊柱腫瘤35例，強(qiáng)直性脊柱炎5例，化膿性關(guān)節(jié)炎6例，腰椎退行性病變12例，骨折患者6例。

兩組患者的年齡經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)(t=-1.117，P=0.266)，性別經(jīng)卡方檢驗(yàn)(χ2=0.131，P=0.717)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、 方法

1. T-SPOT.TB試驗(yàn)操作方法：采用 T-SPOT.TB檢測(cè)試劑盒(英國(guó)Oxford Immunotech公司提供)并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者均于住院次日凌晨空腹抽靜脈血5 ml，肝素抗凝，用標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，以自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并調(diào)制成濃度為2.0×106/ml的細(xì)胞懸液。以細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，植物血凝素(PHA)作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(CFP-10)作為刺激抗原。4個(gè)孔內(nèi)分別加入含250 000 個(gè)PBMCs細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，2 ℃～8 ℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min后終止反應(yīng)。觀察結(jié)果，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)(CTL-ImmunoSpot?S5 Versa Analyzer)記錄斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6個(gè)時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，結(jié)果即為陽(yáng)性；若空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果為陽(yáng)性；若空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥10個(gè)或陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<20個(gè)，試驗(yàn)無(wú)效。

2.結(jié)核抗體檢測(cè)：所有患者均行血清學(xué)結(jié)核分枝桿菌特異性IgG抗體檢測(cè)。結(jié)核分枝桿菌抗體免疫印跡法試劑盒由北京宜安泰醫(yī)療技術(shù)開發(fā)有限公司提供，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)果判定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。預(yù)測(cè)值和似然比按下列公式計(jì)算：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/總陽(yáng)性例數(shù)，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/總陰性例數(shù)，陽(yáng)性似然比=真陽(yáng)性率/假陽(yáng)性率，陰性似然比=假陰性率/真陰性率。T-SPOT.TB試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)與結(jié)核抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)之間的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，以組織病理學(xué)及羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性至少其中一項(xiàng)為金標(biāo)準(zhǔn)，T-SPOT.TB方法敏感度和特異度分別為93.5%(86/92)和78.1%(50/64)；結(jié)核抗體檢測(cè)的敏感度和特異度分別為64.1%(59/92)和81.3%(52/64)。T-SPOT.TB方法在92例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中86例陽(yáng)性，結(jié)核抗體檢測(cè)59例陽(yáng)性，92例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者兩者的重疊率為60.9%(56/92)，抗結(jié)核抗體檢測(cè)陽(yáng)性而T-SPOT.TB檢測(cè)陰性者2例；T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性而抗結(jié)核抗體檢測(cè)陰性者27例；兩者均陰性2例。兩組方法的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法特異度相近，但T-SPOT.TB方法陽(yáng)性檢出率高于抗結(jié)核抗體檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.72，P<0.01)(表1)。

表1 T-SPOT.TB試驗(yàn)與結(jié)核抗體檢測(cè)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的診斷價(jià)值

討 論

1.抗結(jié)核抗體對(duì)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的現(xiàn)狀：對(duì)于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷，尤其早期骨關(guān)節(jié)滑膜結(jié)核的診斷，由于難于取材供細(xì)菌學(xué)和組織學(xué)檢查，血清及各種體液特異度抗體的檢查就變得非常需要。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)血清標(biāo)本中結(jié)核抗體IgG的原理是通過(guò)對(duì)包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的13種分枝桿菌菌體多肽抗原成分及結(jié)核病患者血清中結(jié)核分枝桿菌特異性抗體譜的分析,純化出結(jié)核分枝桿菌H37Rv株菌體特異性多肽抗原成分，相對(duì)分子質(zhì)量介于34 000～43 000 的蛋白質(zhì)抗原)，從而檢測(cè)血清標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌抗原的抗體[6]。本研究中進(jìn)行結(jié)核抗體檢測(cè)的92例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，59例陽(yáng)性，敏感度僅為64.1%，這可能與不同個(gè)體的免疫狀態(tài)有關(guān)；或患者正處于臨床感染的窗口期，可表現(xiàn)為抗體檢測(cè)陰性。本檢測(cè)的特異度81.3%，考慮原因如下：決定結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)特異度的關(guān)鍵在于抗原的選擇，目前重要的結(jié)核分枝桿菌感染血清檢測(cè)抗原大多同時(shí)存在于非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)中，本實(shí)驗(yàn)中結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑是經(jīng)過(guò)Mtb與BCG蛋白組學(xué)電泳對(duì)比純化出的BCG缺失蛋白成分，應(yīng)具有較好的特異性，但是電泳分離不可避免微量BCG共有蛋白的污染[7]，造成假陽(yáng)性的增高。

2.T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中應(yīng)用：近來(lái)，T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)的基本原理在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌γ干擾素(INF-γ)的T淋巴細(xì)胞，已經(jīng)成為一種新的結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷工具。通過(guò)結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)基因編碼產(chǎn)生的ESAT-6和CFP-10來(lái)刺激機(jī)體T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生特異細(xì)胞因子γ干擾素來(lái)診斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染[8]。這2種蛋白為結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，其編碼基因在BCG和絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的基因編碼區(qū)是不存在的，因而從根本上避免了傳統(tǒng)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)中所存在的BCG交叉抗原反應(yīng)，從而確保T-SPOT.TB具有較高的特異度。同時(shí)T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)自身的敏感度也較高，每100萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中即可檢測(cè)到一個(gè)特異性T淋巴細(xì)胞，對(duì)于肺外結(jié)核的診斷，T-SPOT.TB具有較高的敏感度。本研究應(yīng)用T-SPOT.TB方法檢測(cè)的92例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，86例T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其敏感度為93.5%，此結(jié)果與Kim等[9]的研究結(jié)果一致。T-SPOT.TB的敏感度顯著高于結(jié)核抗體檢測(cè)技術(shù)(P<0.05)，因此T-SPOT.TB方法在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷中具有更重要的輔助診斷價(jià)值。

3.T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)的局限：本研究中，在64例非結(jié)核性骨關(guān)節(jié)疾病患者中，12例(18.8%)T-SPOT.TB結(jié)果陽(yáng)性，導(dǎo)致本研究的特異度偏低。這主要是由于中國(guó)屬于結(jié)核病高發(fā)病區(qū)，2010年統(tǒng)計(jì)的活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為459/10萬(wàn)[10]，發(fā)病率位居世界第二，結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者占總?cè)丝诘?4.5%[11]。T-SPOT.TB檢測(cè)技術(shù)不能區(qū)分LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病[12-13]，其特異度受該地區(qū)LTBI流行情況影響，即使沒有明確的結(jié)核病暴露史也有可能已存在LTBI，LTBI的高流行背景可能導(dǎo)致了T-SPOT.TB試驗(yàn)的低特異度。所以不能僅憑借T-SPOT.TB 試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果就診斷活動(dòng)性結(jié)核病，仍需結(jié)合患者的臨床病史、放射學(xué)診斷以及其他診斷方法做出綜合的判斷。

綜上所述，在臨床上疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，在缺乏病原學(xué)依據(jù)的時(shí)侯，T-SPOT.TB試驗(yàn)作為一種非侵入性且便利的輔助診斷方法，其陽(yáng)性結(jié)果能給臨床醫(yī)生提供更多診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核的有用信息。為了更為準(zhǔn)確判斷T-SPOT.TB試驗(yàn)在我國(guó)這種結(jié)核病高流行國(guó)家的骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的輔助診斷價(jià)值，在以后的研究中還需要擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行前瞻性研究，尤其是其特異度可能受LTBI的影響，有待進(jìn)一步研究。

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