白肛海地瓜雙酶水解物的制備及其對人皮膚細(xì)胞的生長和膠原蛋白合成的作用

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(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

白肛海地瓜也稱東海海參,屬于棘皮動物門,海參綱,芋參目,尻參科,海地瓜屬,廣泛分布于我國東部沿海,儲量豐富。與日常食用的刺參相比,白肛海地瓜體壁肉質(zhì)較硬,口感較差,利用率低,但就其營養(yǎng)成分而言,白肛海地瓜含有豐富蛋白質(zhì),幾乎與刺參相當(dāng)[1],體壁富含膠原蛋白,其水解肽更具有多種生物活性功效,同時(shí)白肛海地瓜含有一些皂苷和海參多糖[2]。

目前對于白肛海地瓜水解物的制備方法以及評價(jià)指標(biāo),多數(shù)采用的是酶解法、可溶性氨基態(tài)氮,侯付景[3]等以可溶性氨基態(tài)氮為指標(biāo),利用復(fù)合蛋白酶水解海地瓜,經(jīng)過正交優(yōu)化獲得較高的氨基酸態(tài)氮。有研究表明雙酶水解法比單酶水解可以獲得更高的水解度[4 - 5]。近年,在細(xì)胞培養(yǎng)模式上研究海地瓜功能的相關(guān)報(bào)道很少,本文采用雙酶水解法,以游離總氨基酸含量為評價(jià)指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)確定酶解條件,利用超濾和冷凍干燥技術(shù),獲得不同分子量的水解物干粉,研究該水解物對人類皮膚纖維母細(xì)胞(CCD - 966SK)的增殖以及其細(xì)胞自身合成分泌膠原蛋白的影響,為白肛海地瓜應(yīng)用于保健品、食品添加劑等方面提供參考,也為這種生物提供一種高值化利用的方向。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

白肛海地瓜活體 浙江省象山隅山島海域;人類皮膚纖維母細(xì)胞CCD - 966SK 臺灣食品工業(yè)研究所;總氨基酸試劑盒(T - AA) 中國南京建成生物工程研究所;中性蛋白酶(20萬U/g)、動物蛋白水解酶(20萬U/g) 中國廣西龐博生物工程有限公司;MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Minimum Essential Medium,Earle’s)、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉 Invitrogen公司;二甲基亞砜 Sigma公司;WST - 1(水溶性四唑鹽) Abnova公司;膠原檢測試劑盒 Biocolor公司。

水浴鍋DKS - 11 中國寧波江南儀器;Minispin小型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;TG16 - WS臺式高速離心機(jī) 中國成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 海地瓜體壁酶解條件

1. 2. 1. 1 單因素實(shí)驗(yàn) 將白肛海地瓜解剖去除內(nèi)臟,清洗干凈,取體壁。用絞肉機(jī)粉碎,混勻用于以下酶解實(shí)驗(yàn)。

采用中性蛋白酶與動物蛋白酶,酶濃度為2%,酶比例1∶ 1(w/w,g/g),液料比3∶ 1(v/w,mL/g),酶解溫度分別為30、40、45、50、55、60和70℃,水解2h,然后100℃滅酶活5min,冷卻后4500r/min離心20min,取上清檢測游離總氨基酸含量,考察酶解溫度對酶解效果的影響;在最佳酶解溫度的前提下,酶濃度為2%,酶比例1∶ 1,液料比3∶ 1,分別酶解1、2、3、4、5h,滅活方法、離心方法同上,取上清檢測游離總氨基酸含量,考察酶解時(shí)間對酶解效果的影響;在最佳酶解溫度、酶解時(shí)間的前提下,酶比例1∶ 1、液料比3∶ 1,分別在酶濃度為0. 5%、1%、2%、3%、4%下酶解,滅活方法、離心方法同上,取上清檢測游離總氨基酸含量,考察酶濃度對酶解效果的影響;在最佳酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度的前提下,液料比3∶ 1,酶的比例設(shè)定1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3、2∶ 1、2∶ 3、3∶ 1、3∶ 2,滅活方法、離心方法同上,取上清檢測游離總氨基酸含量,考察酶比例對酶解效果的影響;在最佳酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度、酶比例的前提下,液料比0. 125∶ 1、0. 25∶ 1、0. 5∶ 1、1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1、5∶ 1,滅活方法、離心方法同上,取上清檢測游離總氨基酸含量,考察液料比對酶解效果的影響。

1. 2. 1. 2 正交實(shí)驗(yàn) 將單因素實(shí)驗(yàn)中得出的酶比例、料液比作為固定值,探討加酶量、溫度、時(shí)間這3個(gè)因素,按照正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酶解,并測定總氨基酸含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1. 2. 2 超濾制備不同分子量的酶解產(chǎn)物 將最適條件下制備的白肛海地瓜體壁酶解液8000r/min離心10min,上清液利用超濾膜(MILLIPORE,美國)獲得分子量為1、5、10ku的樣品[6 - 7]。

1. 2. 3 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

1. 2. 3. 1 細(xì)胞的增殖 細(xì)胞培養(yǎng):將人類皮膚纖維母細(xì)胞CCD - 966SK,以MEM培養(yǎng)基(其中含10%FBS、1%青 - 鏈霉素、1%非必需氨基酸以及1%丙酮酸鈉)在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),每2 ～ 3d換液[8 - 9]。

對細(xì)胞增殖的作用:按照每孔1×104個(gè)CCD -966SK細(xì)胞接種于96孔板,并加入樣品(以含10%胎牛血清的MEM全培養(yǎng)液配制),每孔總體積100μL。48h后,每孔加8μL的水溶性四唑鹽WST - 1,2h后于450nm處測吸光值,并計(jì)算細(xì)胞相對存活率:

細(xì)胞相對存活率(%)=(A樣品- A空白)/(A對照-A空白)× 100

1. 2. 3. 2 膠原蛋白的合成 膠原蛋白的含量采用膠原蛋白檢測試劑盒[10 - 11](Sircol Collagen assay)測定。取20μL細(xì)胞的上清培養(yǎng)液(以相同量的培養(yǎng)液作為對照組),依次加入20μL的0. 5mol/L的醋酸以及100μL的染色液于1. 5mL的離心管中,室溫下混合反應(yīng)30min。以15000r/min,4℃離心20min后,去除上清液。再加入100μL的堿試劑,振蕩1min左右使沉淀完全溶解。取100μL于540nm處測吸光值。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白依次稀釋成0、0. 03125、0. 0625、0. 125、0. 25、0. 5mg/mL的濃度,方法同上,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取96孔板,每孔接入6×104個(gè)CCD - 966SK細(xì)胞,并加入不同濃度的酶水解物樣品(以不含胎牛血清的MEM培養(yǎng)液配制),每孔總體積120μL(不含胎牛血清)。72h測膠原蛋白含量。

取24孔板,每孔接入6×104個(gè)/mL的CCD -966SK細(xì)胞,并加入濃度為10mg/mL和0. 1mg/mL的樣品(以無FBS的MEM培養(yǎng)液配制),每孔總體積1mL(不含胎牛血清)?？瞻捉M為不加胎牛血清的MEM培養(yǎng)液,對照組為含細(xì)胞的不加胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。分別測定第0d、第2d、第4d、第8d、第12d的膠原蛋白濃度。

1. 3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用SAS軟件(One - way ANOVA)、GraphPad Prism 5分析并繪制成圖。

2 結(jié)果與討論

2. 1 酶解溫度對酶解效果的影響

圖1a結(jié)果顯示,隨著溫度的升高,游離總氨基酸含量逐漸升高,50℃時(shí)達(dá)到最大值,然后隨著溫度的升高,游離氨基酸含量逐漸減少,至60℃時(shí),趨于平緩,這是因?yàn)檫^高的溫度會使蛋白酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,酶活力降低或使酶失活。因此最適宜酶解溫度選擇50℃。

2. 2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

如圖1b結(jié)果顯示,隨著酶解時(shí)間的延長,酶解液中的游離總氨基酸含量持續(xù)增加,但在4h時(shí)增加減緩趨勢,所測定的游離總氨基酸含量與5h時(shí)基本持平,曲線趨于平緩,而兩個(gè)時(shí)間段相差1h,出于時(shí)間因素考慮,選擇4h為最適宜酶解時(shí)間。

2. 3 酶濃度對酶解效果的影響

如圖1c所示,總酶濃度在0. 5%到2%時(shí),酶解液中的游離總氨基酸含量持續(xù)增加,之后開始出現(xiàn)減緩趨勢,3%與4%時(shí)的游離總氨基酸含量基本持平,基于成本因素考慮,選擇酶濃度為3%。

2. 4 酶的比例對酶解效果的影響

研究結(jié)果如圖1d。動物蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比為1∶ 3時(shí)的游離總氨基酸含量最少,而在3∶ 2時(shí)的酶解液游離總氨基酸含量最高,平均249. 649μmol/mL。兩者的數(shù)據(jù)差異明顯,一方面可能是由于動物蛋白酶可以特異性水解的肽鍵在白肛海地瓜內(nèi)含量較多,使得動物蛋白酶可以水解較多的底物,而相對的中性蛋白酶可以特異性水解的肽鍵較少,這使得當(dāng)動物蛋白酶與中性蛋白酶的酶比例最小為1∶ 3時(shí),所得的酶解效果最差;另一方面,游離氨基酸含量是最終兩種酶共同作用于底物的結(jié)果,其中的酶解機(jī)制復(fù)雜,酶比例為3∶ 2時(shí)恰恰使兩種酶作用下獲得最佳水解效果,相比之下,酶比例為1∶ 3時(shí)的酶解效果最差。因此選擇含量最高的3∶ 2作為動物蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比。

2. 5 液料比對酶解效果的影響

結(jié)果見圖1e所示,游離總氨基酸含量隨著液料比的增加逐漸提高,而水與海地瓜的比例為0. 25∶ 1時(shí)游離氨基酸總量要顯著高于其他7組,隨后隨著液料比的增加,游離氨基酸含量逐漸降低,其中5∶ 1組含量最少,這可能是由于加水量過多和過少易使酶與海地瓜碎塊接觸的面積減少,使酶解不徹底[4]。因此最適宜液料比選擇0. 25∶ 1。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of single - factor experiments

2. 6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果

基于上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在動物蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比為3∶ 2,液料比為0. 25∶ 1的條件下,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討溫度、時(shí)間、加酶量對游離總氨基酸含量的影響,以確定最適宜酶解反應(yīng)條件。從表2中可以看出,極差R以溫度最高,因此三個(gè)因素中酶解溫度對樣品產(chǎn)生游離總氨基酸的影響最大,其次是加酶量、酶解時(shí)間。正交表中得出的最適宜酶解條件為A3B2C2,即加酶量4%、溫度50℃、時(shí)間4h,與單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果基本一致。

2. 7 超濾結(jié)果

在最適條件下制備白肛海地瓜體壁酶水解物,利用超濾截留小于1、5、10ku的多肽,再加上未用超濾處理的酶解液原液,總共4個(gè)樣本,依次標(biāo)為CP1、CP2、CP3、CP4,并將這4個(gè)樣本冷凍干燥獲得干粉。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表分析結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2. 8 對CCD - 966SK細(xì)胞增殖的影響

由圖2可以看出,在細(xì)胞接種量為1×104個(gè)/孔、共培養(yǎng)48h的條件下,除了濃度為1mg/mL的樣品CP4在相對存活率上沒有顯示出增殖的效果外,其他樣品均顯示出促進(jìn)CCD - 966SK細(xì)胞增殖的能力。其中添加了0. 1mg/mL CP3的實(shí)驗(yàn)組,它的相對存活率(156. 232%)顯著高于其他組。而在高濃度1mg/mL時(shí),CP1、CP2、CP3、CP4均顯示出較低的細(xì)胞相對存活率。可能由于加入高濃度的樣品使細(xì)胞的滲透壓發(fā)生改變,從而在一定程度上抑制了細(xì)胞的增殖,CP4又是未用超濾處理的酶解產(chǎn)物原液,所含的大分子物質(zhì)較多,也使?jié)舛葹?mg/mL時(shí)的CP4樣品組呈現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。周怡昆[12]等對外周神經(jīng)雪旺細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)短期高糖可通過高滲透壓抑制RSC96雪旺細(xì)胞的增殖。有研究顯示一些水解物在一定條件下可提高細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖。Kwon[13]等將含大豆蛋白水解物的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶細(xì)胞,結(jié)果表明含0. 5%水解物的無血清培養(yǎng)基可使家蠶細(xì)胞的密度提高至1. 1×107細(xì)胞/mL。

圖2 白肛海地瓜酶水解物對CCD - 966SK的增殖作用Fig. 2 Effects of A. Leucoproata enzymatic hydrolysates on proliferation function of CCD - 966SK

2. 9 促進(jìn)CCD - 966SK細(xì)胞合成膠原蛋白

皮膚組織中的膠原蛋白是維持皮膚彈性的主要因子之一,同時(shí)也主導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間黏著、細(xì)胞增殖及分化。皮膚纖維母細(xì)胞具有分泌膠原蛋白及胞外基質(zhì)以維持皮膚彈性的功能,并且可分泌膠原蛋白至胞外,在此基礎(chǔ)上,可研究皮膚細(xì)胞膠原蛋白的合成情況。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基通常含有血清,可以為細(xì)胞提供多種營養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞的生長,還可保護(hù)細(xì)胞使其免受一些損傷,但也有一些缺點(diǎn),如批次間差異大、成分不明確等,在某些程度上加大了實(shí)驗(yàn)的誤差。本研究中的膠原蛋白實(shí)驗(yàn)采用無血清培養(yǎng)基,排除了血清對細(xì)胞合成膠原蛋白的影響,也更加體現(xiàn)出白肛海地瓜酶水解物對于促進(jìn)CCD - 966SK細(xì)胞合成膠原蛋白的作用。

圖3 不同濃度的白肛海地瓜酶水解物對CCD - 966SK細(xì)胞合成膠原蛋白的影響Fig. 3 Effects of different concentration of A. leucoproata enzymatic hydrolysates on stimulating collagen protein synthesis of CCD - 966SK cells注:1、2、3、4分別代表酶水解液樣品CP1、CP2、CP3、CP4;*:與空白組比較有顯著性差異(p<0. 05)。

圖3中的直線圖為膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=1. 5683x+0. 0592,R2=0. 9915,柱狀圖顯示了不同濃度的白肛海地瓜酶水解物對CCD - 966SK細(xì)胞合成膠原蛋白的情況。圖3表明在細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/孔,培養(yǎng)72h后,酶水解物明顯促進(jìn)了CCD -966SK細(xì)胞合成膠原蛋白,濃度為1mg/mL和0. 01mg/mL的組中所測得的膠原含量相對較高,其中尤其以加了1mg/mL CP2組的膠原量最為明顯,與空白組相比差異顯著。穆源浦[14]等研究一種深海魚類中精制提煉的魚蛋白提取物對人體皮膚水分、油分的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果顯示該提取物具有保持皮膚水分作用,可在一定程度上改善人體的皮膚狀況。由圖4可以得出,在第8d,實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用,各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的膠原蛋白含量要顯著高于其他時(shí)間組。在CP1、CP2、CP3、CP4四個(gè)樣品中,無論是濃度1mg/mL還是0. 01mg/mL,CP4所測得的膠原蛋白含量與其他組相比都是最少的,其次是CP3,而加了CP2組的膠原量最高。因此,相對其他分子量范圍而言,在5ku以內(nèi)的水解產(chǎn)物對CCD - 966SK細(xì)胞膠原蛋白合成分泌的影響最大。

圖4 白肛海地瓜酶水解物對CCD - 966SK細(xì)胞膠原蛋白合成的影響Fig. 4 Effects of A. leucoproata enzymatic hydrolysates on stimulating collagen protein synthesis of CCD - 966SK cells注,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表空白組、對照組、1mg/mL的CP1、1mg/mL的CP2、1mg/mL的 CP3、1mg/mL的CP4、0. 01mg/mL的CP1、0. 01mg/mL的CP2、0. 01mg/mL的CP3、0. 01mg/mL的CP4。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn),確定在動物蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比為3∶ 2、液料比(水:海地瓜碎塊)為0. 25∶ 1的條件下,雙酶水解海地瓜體壁碎塊的最適宜工藝條件為:加酶量4%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間4h。將在此最適宜工藝條件下制成的酶解液制成不同分子量范圍的粉末狀水解物,這些水解產(chǎn)物對CCD - 966SK細(xì)胞無毒性,均可在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加膠原蛋白的合成,同時(shí),相對其他分子量范圍而言,在5ku以內(nèi)的粉末狀水解產(chǎn)物對CCD - 966SK細(xì)胞膠原蛋白合成分泌的影響最大。白肛海地瓜水解物的制備工藝簡單,原料價(jià)格低廉,在食品相關(guān)領(lǐng)域具有一定的開發(fā)前景。

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