槲皮素降低TGF-β1誘導(dǎo)的風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞I型膠原蛋白生成

王 健，吉健華，全 瑛，王醫(yī)林，趙花妮

(西安市第五醫(yī)院風(fēng)濕科，陜西西安710000)

風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞生成的膠原蛋白與心肌纖維化關(guān)系緊密，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)又在風(fēng)濕性心臟病纖維化過程中發(fā)揮著重要作用［1］。槲皮素是一種具有多種生物學(xué)功能的多羥基黃酮類化合物，但是槲皮素對(duì)風(fēng)濕性心臟病的作用不明。體外培養(yǎng)的風(fēng)濕性心肌細(xì)胞，觀察槲皮素對(duì)風(fēng)心病是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料:西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供左室乳頭肌(瓣膜置換術(shù)的風(fēng)濕性心臟病患者，研究獲得西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)書及受試者簽署知情同意書);TGF-β1(Roche applied science);槲皮素來自北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 方法:1)風(fēng)心病患者心肌細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)，左室乳頭肌行細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)。加入TGF-β1:0、2.5、5和10μg/L，孵育48 h，觀察膠原蛋白合成變化。5μg/L TGF-β1干預(yù)基礎(chǔ)上，加入 0、25、50和 100μmol/L槲皮素，觀察其對(duì)TGF-β1促膠原蛋白生成影響。2)RT-PCR檢測(cè)前膠原基因表達(dá):提取細(xì)胞總 RNA，測(cè)定濃度。將0.5μg RNA合成cDNA，以GAPDH為參照基因來擴(kuò)增Ⅰ型前膠原基因。PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為:95℃條件下變性2 min，于94 ℃，30 s，60℃，1 min，68℃，2 min條件來擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后于68℃條件下延伸7 min。10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，經(jīng)EB染色，以目的基因/內(nèi)對(duì)照基因吸光度比值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示檢測(cè)目的基因表達(dá)。3)Western蛋白印跡30μg總蛋白行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h。條帶用薄層掃描儀掃描，軟件分析各條帶吸光度值，計(jì)算1型膠原蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1促進(jìn)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞膠原蛋白合成

表1 TGF-β1促進(jìn)風(fēng)濕性心肌細(xì)胞1型膠原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表1 TGF-β1促進(jìn)風(fēng)濕性心肌細(xì)胞1型膠原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 2.5μg/L;ΔP ＜0.05 compared with 5 μg/L．

group typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.41±0.08 1.16±0.06 TGF-β1(μg/L) 2.5 0.62 ±0.06* 1.65 ±0.11*5 0.86±0.11# 2.08±0.13#10 1.12±0.09Δ 2.85±0.22Δ

2.2 槲皮素抑制TGF-β1對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞膠原蛋白合成誘導(dǎo)作用

表2 槲皮素降低TGF-β1對(duì)風(fēng)濕性心肌細(xì)胞1型膠原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表2 槲皮素降低TGF-β1對(duì)風(fēng)濕性心肌細(xì)胞1型膠原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 25μmol/L;ΔP ＜0.05 compared with 50 μmol/L．

groups typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.89±0.10 2.13±0.12 quercetol(μmol/L)25 0.60±0.09* 1.85±0.13*50 0.43±0.07# 1.43±0.10#100 0.30±0.05Δ 1.10±0.09Δ

3 討論

風(fēng)濕性心臟病主要病理變化就是異常膠原成分沉積所致心肌纖維化，而被增生纖維包繞的心肌細(xì)胞發(fā)生萎縮，并可伴有空泡樣變［2］，因此抑制纖維化發(fā)展將有益于風(fēng)濕性心臟病患者。

風(fēng)濕性心臟病心肌纖維化時(shí)心肌細(xì)胞均參與了膠原蛋白的合成。TGF-β1可通過自分泌調(diào)控方式影響心肌細(xì)胞膠原蛋白生成。通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠劑量依賴性地增加風(fēng)濕性心肌細(xì)胞I型膠原蛋白合成(表1)，這與以往研究結(jié)論是一致的，也為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。設(shè)法降低TGF-β1激活、釋放或拮抗其對(duì)膠原合成作用，有可能為防治風(fēng)心病心肌纖維化提供新的手段。槲皮素能夠發(fā)揮多種生物學(xué)功能，具備抗氧化、抗癌、抗感染、降糖降壓及免疫調(diào)節(jié)等作用［3］，但是其對(duì)風(fēng)濕性心臟病作用研究較少。我們給與培養(yǎng)的心肌細(xì)胞5μg/L TGF-β1預(yù)處理，然后以此給與不同濃度的槲皮素。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，槲皮素劑量依賴性地抑制了TGF-β1的促I型膠原蛋白生成作用(表2)。這些發(fā)現(xiàn)為風(fēng)濕性心臟病防治提供了理論基礎(chǔ)。

［1］Luo F，Zhuang Y，Sides MD，etal．Arsenic trioxide inhibits transforming growth factor-beta1-induced fibroblast to myofibroblast differentiation in vitro and bleomycin induced lung fibrosis in vivo［J］．Respir Res，2014，15:51．

［2］張近寶，劉維永，晏培松，等．風(fēng)濕性心臟病心肌中增殖細(xì)胞核抗原和A2平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)與心功能關(guān)系［J］．中華心血管病雜志，1998;26:274-277．

［3］王曉慶，梁中琴，顧振綸，等．槲皮素抑制血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20:1161-1164．