一種新型殼聚糖/聚乙二醇丙烯酸酯復(fù)合水凝膠制備與性能研究*

肖春宏，楊波，李善吉，李文超

(1臨滄師范高等?？茖W(xué)校數(shù)理系，云南臨滄677000;2嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東梅州514015)

可注射型生物材料通過注射的方法植入體內(nèi)，具有微創(chuàng)性的特點(diǎn)，在組織工程和外科整形方面有著廣泛的應(yīng)用前景［1－7］。水凝膠前驅(qū)物為溶液狀態(tài)，極易注射，在體內(nèi)可快速成型，因此水凝膠體系被廣泛用于可注射型支架。作為可注射型水凝膠支架，水凝膠前驅(qū)物要求有好的生物相容性和生物降解性，并且能在溫和的條件下快速凝膠［8－13］。殼聚糖具有生物降解性和良好的生物相容性，但是酸溶性和凝膠方法限制了殼聚糖作為可注射水凝膠在體內(nèi)組織修復(fù)中的應(yīng)用［14－19］。本研究過程中，依次將聚乙二醇單甲醚(MPEG)和丙烯酰氯(AC)接枝到殼聚糖鏈上，制備了可共價(jià)交聯(lián)的水溶性殼聚糖(CS－PEG－AC)。在本研究中用細(xì)胞毒性較小的光引發(fā)劑(Irgacure2959)在特定波長(365nm)的紫外光作用下引發(fā)CS－PEG－AC聚合。由于光引發(fā)聚合有著可控的聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及聚合反應(yīng)中放熱少等優(yōu)點(diǎn)，光引發(fā)聚合在骨關(guān)節(jié)修復(fù)、牙科、眼科以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。此外，光引發(fā)聚合的可控性還滿足了水凝膠支架的可注射型要求，便于手術(shù)操作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

MPEG－2000，西格瑪，用甲苯共沸干燥除水;環(huán)氧氯丙烷，阿拉丁，使用前用CaO干燥24h;NaOH，廣州試劑廠;殼聚(Chitosan，CS):M=100000，浙江金橋生物化學(xué)有限公司;三乙胺，西格瑪;二氯甲烷，天津富余化學(xué)試劑廠;丙酮，廣州化學(xué)試劑廠;N、N二甲基乙酰胺，廣州化學(xué)試劑廠;甲苯，廣州化學(xué)試劑廠;四氫呋喃，廣州化學(xué)試劑廠;光引發(fā)劑2959。

1.2 Exypo－PEG合成

mPEG(10g，5mmol)60℃真空干燥48h，環(huán)氧氯丙烷epichlorohydrin(30mL)，NaOH(10g，250mmol)加入到裝有磁子的100mL單口圓底燒瓶中，體系用干燥管保護(hù)，室溫下，電磁攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽濾，濾去不溶物，過濾去NaCl及其他副產(chǎn)物，將濾液加入到過量(10倍溶液體積)的乙醚中，至溶液無色，進(jìn)行沉淀，沉淀產(chǎn)品經(jīng)過濾后，室溫下真空干燥24h。得產(chǎn)物7.2g，產(chǎn)率72%。

1.3 殼聚糖－mPEG的合成

2g殼聚糖溶解在300mL含量為0.4%(w/v)的乙酸溶液中。10g環(huán)氧氯丙烷－聚乙二醇單甲醚溶解在適量水20mL中，緩慢滴加到殼聚糖溶液中，混合液在80℃下，磁力攪拌反應(yīng)24h。先用0.05mol/L的NaOH溶液中和至pH在6.2附近，反應(yīng)液裝入截留分子質(zhì)量為Mn=14000透析袋，用去離子水透析除去未反應(yīng)的mPEG和小分子雜質(zhì)，透析72h，中間換水5～6次。然后冷凍干燥。得到PEG－chiosan然后用過量丙酮洗滌，去除沒反應(yīng)Exypo－PEG.樣品在室溫下真空干燥24h。

1.4 mPEG－Chitosan－Ac的合成

1g PEG－Chitosan(1.74mmol氨基重復(fù)單元，溶于50mL DMAC中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，然后混合液冷卻至0～5℃，加等HCl產(chǎn)生化學(xué)計(jì)量的三乙胺，量取0.15倍殼聚糖氨基摩爾量的丙烯酰氯(溶于10mL無水二氯甲烷)緩慢滴加到上述混合液中。0～5℃反應(yīng)4h。室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后，溶液過濾后緩慢倒入過量(10倍)丙酮中沉淀，過濾后真空干燥，溶于200倍去離子水中，得到的溶液裝入透析膜(截留分子量140kDa，透析膜，纖維素膜，Sigma)，在去離子水中透析3d除去未反應(yīng)的小分子，透析后得到的冷凍干燥。

1.5 水凝膠的溶脹比

水凝膠凍干后稱重為W0，干的水凝膠浸入37℃的水中一定時(shí)間，稱水凝膠重量為W1，平衡溶脹比定義為(W1－W0)/W0。

1.6 水凝膠的失重

200μL的水凝膠置于37℃的4mL 1mg/mL溶菌酶的PBS中。稱量不同時(shí)間下水凝膠的重量為Wt，水凝膠失重定義為(W0－Wt)×100%/W0，W0為水凝膠的起始的重量。

1.7 水凝膠的粘彈性

將大分子單體溶于PBS中，加入引發(fā)劑使其最終濃度為0.05%。將上述溶液注射到圓形透明的模具(直徑25mm，高度5rnrn)中，然后將模具放在紫外燈下照射，10min后形成水凝膠。將水凝膠取出后放在PBS溶液中24小時(shí)使其溶脹。用流變儀(ARES，Advaneed助eometrieE卻ansionSystem)的應(yīng)力控制的動(dòng)態(tài)擺動(dòng)模式測定溶脹后的樣品的儲能模量和損耗模量。所有的測試都是在37℃進(jìn)行的，應(yīng)變設(shè)定在1%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用完全隨機(jī)因素方差分析(one–way ANOVA)。結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)p＜0.05時(shí)，有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 大分子單體的制備

Epoxy－PEG的核磁共振譜圖(300MHz，CDCl3)如圖1所示。

圖1 Epoxy-PEG的核磁譜圖Fig.1 1H NMR Sprectum of Epoxy-PEG

從圖1可知，化學(xué)位移(δ)在3.2、2.8和2.6ppm處的信號為Epoxy－PEG的環(huán)氧端基的特征峰。c峰與d峰的積分面積之比1∶3，說明PEG的端基幾乎完全轉(zhuǎn)化為環(huán)氧基團(tuán)。

將殼聚糖接枝到環(huán)氧－PEG上，用透析袋透析除去未接枝上殼聚糖的環(huán)氧PEG及其他小分子雜質(zhì)，所得產(chǎn)物為mPEG－CS。其核磁譜圖(300MHz，CDCl3)如圖2所示。

圖2 mPEG-CS的核磁譜圖Fig.2 1H NMR Sprectum of mPEG-CS

從圖2中可以看出，，化學(xué)位移(δ)1.7－1.8為(NHAc)特征峰，2.6－4.4為(H－2，H－3，H－4，H－5，H－6，N－CH2－PEG)吸收峰，3.2為－OCH3吸收峰。

同時(shí)，可以根據(jù)核磁計(jì)算出mPEG的取代度(degree of substitution，DS)，即mPEG分子的摩爾數(shù)占?xì)ぞ厶擎湽?jié)摩爾數(shù)的百分比為:DS=(I3.0ppm/3I2.8ppm)×100=20%。式中的3.0是PEG上CH3的H，2.8ppm是chitosan H2。

通過?；磻?yīng)將丙烯酰氯接枝到mPEG－CS制備mPEG－CS－Ac，所得產(chǎn)物核磁譜如圖3所示。

圖3 PEG-CS-Ac的核磁譜圖Fig.3 1H NMR Sprectum of PEG-CS-Ac

從圖3可知，5.8－6.4為雙鍵CH2、CH的峰，說明雙鍵已接枝到大分子單體上，接枝率可以用雙鍵/氨基來計(jì)算，DS=(I5.8ppm/I3.3ppm)×100=13%。

2.2 聚合反應(yīng)

將5%的PEG－Chitosn－Ac水溶液加入0.05%引發(fā)劑的離心管中。充分?jǐn)嚢杈鶆蚧旌虾螅x心管在置于強(qiáng)度為10Mw/cm2的365nm的紫外燈下進(jìn)行聚合反應(yīng)。

2.3 溶脹行為

37℃下，水凝膠CS－PEG－AC/PEGDA在pH=7.2的緩沖液PBS中溶脹24后的溶脹率如圖4所示。由圖4可知，隨著PEGDA的含量的增加，溶脹性能逐漸減小，從22.3倍減少到13.6倍，這主要是隨著PEGDA的量增加，交聯(lián)密度增加，溶脹性能受到抑制。這一點(diǎn)從溶脹后凍干的水凝膠的SEM(如圖6所示)也可以看出，隨著PEGDA的量增加，水凝膠的孔密度是逐漸增加的。這和溶脹率相一致。

圖4 水凝膠CS-PEG-AC/PEGDA在緩沖液PBS中溶脹后的溶脹率Fig.4 The degree of swelling of the CSPEG-AC/PEGDA hydrogels in PBS

2.4 降解行為

用2%的大分子單體聚乙烯醇－殼聚糖－丙烯酰氯(PEG－CS－Ac)分別和4%、6%、8%及10%的聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)合成四種水凝膠，并在37℃時(shí)，在1mg/mL溶菌酶的PBS中，對2%～4%，2%～6%，2%～8%和2%～10%四種水凝膠在溶菌酶中的降解速率進(jìn)行了測試，結(jié)果如圖5所示。

圖5 2%～4%、2%～6%、2%～8%和2%～10%水凝膠在1mg/mL溶菌酶的PBS中的降解速率Fig.5 degradation rate of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%hydrogels in 1mg/mL lysozyme/PBS

由圖5可知，隨著PEGDA的量增加，降解速率是逐漸減小的。第一天到第14天，降解速率相對比較穩(wěn)定，但是和其他的水凝膠相比，2%～4%降解的速率較快點(diǎn)，在第21天完全分散，而其他的水凝膠還是好的，降解速率相對比較平緩。這和降解后的水凝膠的SEM相一致(如圖6所示)。

圖6 2%～6%and 2%～10%水凝膠在1mg/mL溶菌酶PBS(37℃)中降解SEM圖(A1，A2為7天，B1，B2為14天，C1，C2為21天)Fig.6 SEM image of degradation of 2%～6%and 2%～10%hydrogels in 1mg/mL lysozyme/PBS at 37℃(A1，A2 with 7d，B1，B2 with 14d，C1，C2 with 21d)

2.5 粘彈性

殼聚糖類水凝膠的儲能模量和損耗模量如圖7所示。

圖7 2%～4%、2%～6%、2%～8%、2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA水凝膠隨相應(yīng)頻率作用時(shí)的儲能模量(A)和損耗模量(B)(應(yīng)變和溫度分別為1%和37℃)Fig 7 Storage modulus(A)and loss modulu(B)of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA hydrogels as a function of compressing frequency(Strain and temperature were set as 1%and 37℃，respectively)

由圖7可知，隨著PEGDA的量增加，降儲能模量和損耗模量緩慢增加，隨著頻率的增加，同一種水凝膠的降儲能模量和損耗模量緩慢增加。降儲能模量較之于損耗模量是其十幾倍，這說明所制備的水凝膠是彈性體，這和損耗因子(Eta)隨著頻率的增大表現(xiàn)出的非牛頓流體行為相一致(如圖8所示)。

圖8 2%～4%、2%～6%、2%～8%、2%～10%CSPEG-AC/PEGDA水凝膠隨相應(yīng)頻率作用下的損耗因子(應(yīng)變和溫度分別為1%和37℃)Fig.8 Eta of 2%～4%，2%～6%，2%～8%，2%～10%CS-PEG-AC/PEGDA hydrogels as a function of compressing frequency(Strain and temperature were set as 1%and 37℃，respectively)

3 結(jié)論

(1)合成了mPEG接枝率為16%、丙烯酰氯接枝10%的可交聯(lián)聚合的水溶性殼聚糖(CS－PEGAC)。CS－PEG－AC在光引發(fā)劑(Irgacure2959)的引發(fā)下聚合，形成水凝膠，反應(yīng)條件溫和。

(2)水凝膠吸收水分后可以溶脹至原重量13.2倍到22.6倍。當(dāng)PEGDA含量增加時(shí)，交聯(lián)密度較高、水凝膠的平衡溶脹比較低。水凝膠的粘彈性實(shí)驗(yàn)表明水凝膠的儲能模量在0.8kPa～1kPa，損耗模量在0.2Pa～100Pa。交聯(lián)密度較高的水凝膠，儲能模量和損耗模量也相對較高。在含溶菌酶的PBS中降解相對較慢。

［1］E Marsano，E Bianchi，S Vicini，L Compagnino，A Sionkowska，J Skopińska，M Wis'niewski.Stimuli responsive gels based on interpenetrating network of chitosan and poly(vinylpyrrolidone)［J］.Polymer，2005，46(5):1595－1600.

［2］Allan S Hoffman.Hydrogels for biomedical applications［J］.Advanced drug delivery reviews，2002，54(1):3－12.

［3］Langer R and Vacanti J P.Tissue engineering［J］.Science，1993，260，920.

［4］Wang D A，Williams C G，Li Q，Sharma B，Elisseeff J H.Synthesis and characterization of a novel degradable phosphate－containing hydrogel［J］.Biomaterials，2003，24(22):3969－80.

［5］Gong Y，He L，Li J，Zhou Q，Ma Z，Gao C，Shen J.Hydrogel－filled polylactide porous scaffolds for cartilage tissue engineering［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，82(1):192－204.

［6］G M Cruise，D S Scharp，J A Hubbell.Characterization of permeability and network structure of interfacially photopolymerized poly(ethylene glycol)diacrylate hydrogels［J］.Canadian Metallurgical Quarterly，1998，19(14):1287－1294.

［7］Wang D A，Williams C G，Yang F，Cher N，Lee H，Elisseeff J H.Bioresponsive phosphoester hydrogels for bone tissue engineering［J］.Tissue Eng，2005，11(1－2):201－13.

［8］Hong Y，Song H，Gong Y，Mao Z，Gao C，Shen J.Covalently crosslinked chitosan hydrogel:properties of in vitro degradation and chondrocyte encapsulation［J］.Acta Biomater，2007，3(1):23－31.

［9］Wang Dong－An，Varghese Shyni，Sharma Blanka，Strehin Iossif，F(xiàn)ermanian Sara，Gorham Justin，F(xiàn)airbrother D Howard，Cascio Brett，Elisseeff Jennifer H.Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue－biomaterial integration［J］.Nature materials，2007，6(5):385－392.

［10］Shu X Z，Liu Y，Palumbo F，Prestwich G D.Disulfide－crosslinkedhyaluronan－gelatinhydrogel films:a covalent mimic of the extracellular matrix for in vitro cell growth［J］.Biomaterials，2003，24(21):3825－34.

［11］Yihong Gong，Chunming Wang，Ruenn Chai Lai，Kai Su，F(xiàn)eng Zhanga and Dong－an Wang.An improvedinjectablepolysaccharidehydrogel:modified gellan gum for long－term cartilage regenerationin vitro［J］.J.Mater.Chem，2009，19:1968－1977.

［12］Yan－ming Dong，Wei Mao，Hui－wu Wang，Ya－qing Zhao，Dan－xia Bi，Liu－lin Yang，Qiang Ge，Zi－qi Ou.Electron microscopic studies on planar texture and disclination of cholesteric mesophases in acyloyl chitosan/acrylic acid composite films［J］.Carbohydrate Polymers，2006，65(1):42－48.

［13］Karake?ili A G，Satriano C，Gümü?derelioˇglu M，Marletta G.Enhancement of fibroblastic proliferation on chitosan surfaces by immobilized epidermal growth factor［J］.Acta biomaterialia，2008，4(4):989－996.

［14］Aksungur P，Sungur A，Unal S，Iskit A B，Squier C A，Senel S.Chitosan delivery systems for the treatment of oral mucositis:in vitro and in vivo studies［J］.J Control Release，2004，98(2):269－79.

［15］I M El－Sherbiny，E M Abdel－Bary，D R K Harding.Preparation and in vitro evaluation of new pH‐sensitive hydrogel beads for oral delivery of protein drugs［J］.Journal of Applied Polymer Science，2009，115(5):2828－2837.

［16］Liu Zonghua，Jiao Yanpeng，Zhang Ziyong.Calcium－carboxymethyl Chitosan Hydrogel Base for Protein Drug Delivery System［J］.J.Appl.Polym.Sci，2007，103:3164－3168.

［17］Francesco M Veronese，J Milton Harris.Introduction and overview of peptide and protein pegylation［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54(4):453－456.

［18］Jian Li，Wei－Dong He，Ning He，Shou－Chen Han，Xiao－Li Sun，Li－Ying Li，Bo－Yu Zhang.Synthesis of PEG－PNIPAM－PLys hetero－arm star polymer and its variation of thermo－responsibility after the formation of polyelectrolyte complex micelles with PAA［J］.Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry，2009，47(5):1450－1462.

［19］Hiroki Kiuchi，Weihua Kai，Yoshio Inoue Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)crosslinked chitosan films.Journal of Applied Polymer Science，2007，107(6):3823－3830.