TDZ在木本植物再生中的應(yīng)用趨勢及桑樹中的前景

王旭煒 付杰 王青 陳鴻宇 曾其偉 何寧佳

（家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，重慶 400716）

噻二唑苯基脲（N－phenyl－N－1，2，3－thiadiazol－5－ylurea，TDZ）是人工合成的苯基脲衍生物之一，微溶于水，易溶于DMSO（二甲基亞砜）和DMF（二甲基甲酰胺）。TDZ作為一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有類似腺嘌呤類細胞分裂素的活性，最初被用作棉花脫葉劑[1]。TDZ不僅刺激腋芽，也能夠刺激外植體形成愈傷、誘導(dǎo)器官形成和芽的再生，因此TDZ具有較強的刺激芽擴繁的能力，能夠克服其他細胞分裂素遇到的擴繁難題。特別是TDZ濃度的變化能夠有效影響外植體的發(fā)育形式，如楊樹[2]、草莓[3]、巨尾桉[4]等。

桑樹（Morus spp.）為多年生木本植物，桑葉是家蠶主要的天然飼料，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來，桑樹在石漠化、礦山修改、脆弱生態(tài)環(huán)境修復(fù)等生態(tài)治理中的功能也引起了越來越多的重視和關(guān)注[5－7]。桑樹基因組測序的完成[8]，為研究桑樹基因功能，闡明桑樹耐逆境、富含活性次生物質(zhì)等優(yōu)勢性狀提供了良好的平臺。眾所周知，基于遺傳再生體系的插入突變體技術(shù)[9]、超量表達[10]、RNAi干擾[11]以及最近熱門的鋅指核酸酶[12]、Talen[13]、Cas9[14]等基因編輯技術(shù)是研究基因功能最有利的工具，上述基因功能研究的方法都建立在成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)之上。雖然早在1990年就開始了桑樹轉(zhuǎn)基因探索[15]，在20世紀90年代也做了大量工作[16－19]，但是目前世界上有顯著表型變化的桑樹轉(zhuǎn)基因研究報道數(shù)量極少[17，20－23]。究其原因，桑樹不成熟的遺傳再生體系可能是一個重要的因素，因此建立成熟、穩(wěn)定的桑樹遺傳再生體系是進行桑樹基因功能研究的重要基礎(chǔ)和前提。

TDZ具有生長素和細胞分裂素的雙重功能，許多難以再生的物種采用TDZ能達到高頻分化。近年來，TDZ在許多物種的再生中得到了廣泛的應(yīng)用[24－27]，獲得了重要的研究進展，本文在綜述TDZ在再生體系功能的基礎(chǔ)上，展望了TDZ在桑樹再生體系的功能，為建立成熟穩(wěn)定的桑樹遺傳再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 TDZ促進芽的形成

TDZ具有生長素和細胞分裂素的雙重功能，能誘導(dǎo)許多植物外植體不定芽的形成（表1）。0.05mg/L的TDZ并添加其它激素培養(yǎng)四周后，能100%誘導(dǎo)坪山柚上胚軸產(chǎn)生不定芽，平均不定芽數(shù)為8.35個[24]。與CPPU相比，TDZ更有助于維持虎杖愈傷組織較好的生長活力，在適宜的分化培養(yǎng)基上能夠迅速形成不定芽[25]。表1的結(jié)果表明，芽的再生主要用下胚軸、幼嫩葉片和子葉等外植體，在含有0.2～2μmol/L TDZ或者同時添加一定量的6BA和生長素類激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得。

表1 芽的形成

2 TDZ誘導(dǎo)愈傷組織形成

在多種植物培養(yǎng)體系中添加TDZ都能誘導(dǎo)愈傷組織形成，且愈傷細胞增殖速率大大高于其他植物生長調(diào)節(jié)劑（表2）。TDZ誘導(dǎo)文冠果幼嫩葉片的愈傷組織產(chǎn)生于葉片的邊緣及切口處，30d左右葉片全部形成愈傷組織[26]。在含TDZ培養(yǎng)基中，香椿的葉柄、莖段和葉片3種外植體均形成愈傷組織，愈傷組織的鮮重顯著提高[28]。表2結(jié)果表明，0.1～1mg/L的TDZ能夠有效的誘導(dǎo)植物外植體產(chǎn)生愈傷組織。隨著濃度升高，TDZ依次誘導(dǎo)了葉柄、莖段和葉片等外植體都形成愈傷組織。外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過程中吸收TDZ含量比其他植物生長調(diào)節(jié)劑低，因而有人認為培養(yǎng)的植物體內(nèi)有相當(dāng)高的內(nèi)源TDZ活性物質(zhì)[39－40]。

3 TDZ誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生

植物體細胞胚胎發(fā)生是植物再生的重要途徑之一，也是植物發(fā)育早期階段研究的有效研究模式。TDZ對大多數(shù)植物的體細胞胚胎發(fā)生有促進作用[39]，其中研究最多的是花生、蘭花和天竺葵等植物如表3。TDZ對體細胞胚胎發(fā)生的促進作用可能與處理濃度和時間有關(guān)。體細胞胚胎發(fā)生和芽再生相比，所需的TDZ濃度相對較高，范圍是10～30μmol/L。有報道認為，在植物體細胞胚胎發(fā)生過程中，TDZ能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源植物激素或者相關(guān)的酶活性，或者通過脅迫誘導(dǎo)改變植物生理狀態(tài)[39]。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)

4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

在原生質(zhì)體細胞壁形成初始階段和細胞分裂期間，添加的TDZ（與生物素類物質(zhì)NAA、2，4－D配合使用）濃度在0.001～20μmol/L能夠完成原生質(zhì)體愈傷組織的植株再生（表3）。草莓的原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，TDZ能夠有效地提高原生質(zhì)體的存活能力同時也提高再生頻率[45]。TDZ對誘導(dǎo)原生質(zhì)體愈傷組織植株再生的作用似乎強于細胞分裂素類物質(zhì)反應(yīng)，但是這種效應(yīng)的真正機理仍不清楚[39－40]。

表3 體細胞胚胎發(fā)生和原生質(zhì)體培養(yǎng)

5 TDZ在桑樹組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

TDZ在桑樹組織培養(yǎng)中也得到了大量應(yīng)用。在國內(nèi)，TDZ可顯著提高桑樹葉片愈傷組織和再生芽的誘導(dǎo)率，通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化條件，獲得了93.9%的愈傷組織誘導(dǎo)率和100%的不定芽分化率[42，48－49]。桑樹的冬芽在添加生長激素TDZ的培養(yǎng)基上也能較好地誘導(dǎo)和促進愈傷組織的形成與生長，但會抑制生長芽的再生長[50]。

國外對TDZ在桑樹上的研究主要集中在誘導(dǎo)種子萌發(fā)、促進叢生芽、誘導(dǎo)愈傷組織或者直接誘導(dǎo)不定芽等方面。早在1994年就報道了TDZ誘導(dǎo)桑樹葉片形成再生芽[51]。S.Bhatnagar等用不同濃度（1、2.5、5、10μmol/L）處理印度桑K2和DD的下胚軸、子葉和葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μmol/L TDZ能夠誘導(dǎo)下胚軸的不定芽再生能夠達到50%，子葉的誘導(dǎo)率能夠達到70%，而葉片在含有2.5μmol/L TDZ培養(yǎng)基培養(yǎng)30d后也能夠生產(chǎn)出不定芽，同時也發(fā)現(xiàn)用來源于體外培養(yǎng)的腋芽上的7d的葉片外植體再生效率要好于來源于幼苗和大田的葉片[38]。TDZ也能夠促進印度桑C176和C776的叢生芽生長[53]。來自14d胚的外植體被放置于添加了7μmol/L TDZ的培養(yǎng)基培養(yǎng)45d后，每個外植體能夠得到20.3個再生芽，而在選用的3個品種發(fā)現(xiàn)，S－36的再生效率高于K2和S－1[37]，而S－36的愈傷組織在含有1μmol/L的TDZ培養(yǎng)基上，能夠誘導(dǎo)形成最多數(shù)量的再生芽[37]。將無菌桑樹苗的葉片先放置在含有18.17μmol/L TDZ培養(yǎng)基上8～10d，然后轉(zhuǎn)移入含8.88μmol/L BA的MS培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率達到77.6%～89.2%[53]。Umate等人發(fā)現(xiàn)，印度桑原生質(zhì)體培養(yǎng)的微愈傷能夠在TDZ 4.5μmol/L培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)形成完整的植株[32]。而印度桑品種V1的葉片，在添加TDZ 1.0mg/L培養(yǎng)基中能獲得63%的叢生芽和68%再生率[54]。2008年和2011年，印度桑通過TDZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生植株的轉(zhuǎn)基因文獻相繼報道[20，26，55]，為研究者進一步研究桑樹基因功能和遺傳育種打開窗戶，同時也為其他桑樹的再生提供了參考。

6 討論

研究表明TDZ對不定芽的誘導(dǎo)增殖和對愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著的輔助作用[38，41，56－58]。細胞分裂素的活性研究表明，TDZ具有相當(dāng)廣泛的細胞分裂素活性，可能了刺激內(nèi)源細胞分裂素的生物合成或改變內(nèi)源細胞分裂素的代謝，從而導(dǎo)致天然細胞分裂素的增加[1，59]。此外，TDZ能刺激生長素的從頭合成，如培養(yǎng)在TDZ培養(yǎng)基中的花生幼苗的吲哚基乙胺和色氨酸含量增加[59]。

TDZ處理花生幼苗，花生體內(nèi)的礦質(zhì)元素錳、鐵、銅、鈣、鎂、鉀和ATP、ADP、AMP積累[24，59－60]；TDZ處理后天竺葵根中的蛋白質(zhì)、脫落酸和4－氨基丁酸等與脅迫相關(guān)的代謝物含量增加[60]?？梢?，TDZ誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生和再生可能是植物克服脅迫的外在表現(xiàn)。TDZ提高葉片外植體的再生效率還表現(xiàn)在其能保護葉片細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制氧化物酶的活性，阻止葉片葉綠素的降解，延緩離體葉片的衰老[63]。

TDZ對不定芽的誘導(dǎo)增殖和對愈傷組織的誘導(dǎo)具有最適作用濃度，含量過低時效果不明顯，濃度過高對愈傷組織及不定芽的生長表現(xiàn)出明顯的毒害作用[28]。TDZ誘導(dǎo)芽再生的適宜濃度為0.01～2mg/L，高于此值則有利于愈傷組織和體細胞胚形成。0.01～0.1mg/L TDZ在含有低濃度的0.1～0.5mg/L BA和NAA的培養(yǎng)基中，能夠直接誘導(dǎo)幼嫩葉片和下胚軸產(chǎn)生芽[24，40]；若缺乏BA，TDZ能夠誘導(dǎo)芽形成的適宜濃度需提高到為0.5～2.0mg/L，其原因可能在于BA和TDZ能有效協(xié)同刺激芽的誘導(dǎo)。TDZ誘導(dǎo)愈傷組織的適宜濃度與誘導(dǎo)芽相近或者稍高的原因是，大多數(shù)植物芽的誘導(dǎo)可能先形成愈傷組織，進而植物感受到細胞外環(huán)境的脅迫，進一步誘導(dǎo)芽的形成。TDZ誘導(dǎo)體細胞胚和原生質(zhì)體報道相對較少，單獨添加高于2.0mg/L的TDZ就能夠誘導(dǎo)體細胞胚的發(fā)生，原生質(zhì)體培養(yǎng)的TDZ的適宜濃度為0.001～20μmol/L如（表3）。

TDZ同時具有細胞分裂素和生長素活性，能夠直接誘導(dǎo)葉片、子葉和下胚軸形成再生芽，因而相較于其它細胞分裂素具有獨特的優(yōu)勢。TDZ的這種再生優(yōu)勢在桑樹組織培養(yǎng)中也得到較好應(yīng)用，其最適的濃度為0.5～4mg/L[20－23]。當(dāng)然，TDZ誘導(dǎo)桑樹再生所需時間存在差異，子葉和下胚軸5～10d就能誘導(dǎo)出再生芽，而葉片需要30～40d[38]。此外，采用TDZ先誘導(dǎo)愈傷組織進而誘導(dǎo)芽則需要更長的時間才能獲得再生，在此過程中還需要其它細胞分裂素及生長素的參與[42]。

TDZ誘導(dǎo)桑樹再生除了時間上存在差異外，在組織來源上也存在差異，來源于腋芽的葉片的再生率高于直接來源于野外的葉片或幼苗葉片[38]。這是因為腋芽的葉片適應(yīng)了組培環(huán)境，對TDZ引發(fā)脅迫的耐受性更高，使TDZ能夠持續(xù)作用于葉片。外植體的成熟度也是影響再生的關(guān)鍵因素，擴繁后5～10d的桑樹外植體（子葉和下胚軸）再生率要高于其他時間[38]。

由此可見，TDZ是誘導(dǎo)植物再生的有效激素，可應(yīng)用于桑樹再生體系的建立，前人所做的有益探索，為我們奠定了堅定的基礎(chǔ)。以TDZ為主要激素源，桑樹再生體系探索可以圍繞以下幾個方面進行：①建立高效的桑樹無菌繁殖體系是基礎(chǔ)；②篩選適合的桑樹組織外植體；③根據(jù)再生途徑篩選適宜的TDZ作用濃度；④混合使用其它細胞分裂素、生長素以及AgNO3等提高桑樹再生頻率。目前桑樹學(xué)科已經(jīng)進入基因組時代，高效穩(wěn)定的遺傳再生體系將是研究桑樹基因功能最有效的方法，本文將為桑樹再生體系的建立提供有益的借鑒。

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