非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張 玉，謝銀祿，張國(guó)慶

（1.青海省大通縣長(zhǎng)寧鎮(zhèn)后子河獸醫(yī)站，青海大通810105；2.青海省海西州格爾木市畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木816000；3.青海省大通種牛場(chǎng)，青海大通810100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸傳染性疾病［1］，臨床癥狀類似于經(jīng)典豬瘟（Classical swine fever，CSF），主要特征表現(xiàn)為高熱、嘔吐、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官?gòu)V泛性出血、呼吸障礙、流產(chǎn)及神經(jīng)系統(tǒng)功能改變等［2-3］。ASF于1921年在非洲肯尼亞被首次發(fā)現(xiàn)，目前已流行至非洲、歐洲和美洲等數(shù)10個(gè)國(guó)家和地區(qū)，且仍有不斷蔓延的趨勢(shì)［4-6］。該病傳染性強(qiáng)、發(fā)病快、病程短、病死率高達(dá)100%，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須及時(shí)通報(bào)的動(dòng)物疫病，被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為一類動(dòng)物疫?。?］。目前，該病的防控缺乏行之有效的疫苗和治療藥物，綜合防控面臨著巨大挑戰(zhàn)。在我國(guó)雖未發(fā)現(xiàn)該病，但其從西非至東非、歐洲、亞洲的傳播態(tài)勢(shì)已經(jīng)形成，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的潛在威脅日益增大，一旦侵入我國(guó)，將會(huì)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大的危害，并對(duì)養(yǎng)豬相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊。只有建立快速、準(zhǔn)確、靈敏和特異的ASFV檢測(cè)方法，才能更好地進(jìn)行檢疫，嚴(yán)防該病傳入我國(guó)，故加強(qiáng)該病快速診斷技術(shù)的研究貯備工作具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。論文就非洲豬瘟病毒各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行全面論述，旨在為我國(guó)開(kāi)展非洲豬瘟的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)參考。

1 PCR及多重PCR方法

PCR方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，是實(shí)驗(yàn)室常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，也是目前ASFV較常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。多重PCR方法是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性檢測(cè)引物，同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行快速擴(kuò)增，其可以實(shí)現(xiàn)ASFV與其他病原體的快速鑒別診斷。

Aguero M等［8］和曾少靈等［9］均先后建立了ASFV的PCR檢測(cè)方法，均具有良好的敏感性和特異性，可以檢測(cè)出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。楊霞等［10］利用PCR方法對(duì)河南省不同地市27個(gè)豬場(chǎng)所采集的疑似病料進(jìn)行了ASFV的核酸檢測(cè)，陽(yáng)性檢出為0，表明中國(guó)河南地區(qū)沒(méi)有ASFV的感染與流行。PCR方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，適合普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ASFV的檢測(cè)工作，對(duì)實(shí)現(xiàn)ASFV早期排查具有重要意義。

Aguero M等［11］和張倩等［12］分別建立了檢測(cè)ASFV和CSFV的雙重PCR方法，Aguero M等建立的方法從臨床樣品處理至檢測(cè)結(jié)束整個(gè)過(guò)程在5h內(nèi)即可完成，張倩等建立的方法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，對(duì)CSFV和ASFV的最低檢出量均可以達(dá)到100pg，對(duì)山東聊城地區(qū)58份樣品進(jìn)行檢測(cè)，CSFV陽(yáng)性15份，ASFV陽(yáng)性0份。多重PCR方法可在同一個(gè)體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并且檢測(cè)所耗時(shí)間與常規(guī)PCR方法相當(dāng)，同樣適合于普通實(shí)驗(yàn)室，為ASFV和CSFV的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供了有效的技術(shù)支持。

2 熒光定量PCR及多重?zé)晒舛縋CR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative-PCR，real-time qPCR）是融匯了PCR技術(shù)和光譜技術(shù)的一種核酸定量檢測(cè)技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法相比，解決了PCR假陽(yáng)性和溴化乙錠對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題，且可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。多重?zé)晒舛縋CR方法是在同一個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性檢測(cè)引物，進(jìn)而多種病原體的鑒別診斷。

Fernandez Pinero J等［13］利用通用探針庫(kù)建立了ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了ASFV感染的定量檢測(cè)和鑒定。黃萍等［14］和郭少平等［15］分別針對(duì)ASFV p72基因和K205R基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物和探針，均建立了ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其敏感性可達(dá)100個(gè)拷貝。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性高、特異性強(qiáng)，可同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品，且整個(gè)反應(yīng)在密閉條件下進(jìn)行，相對(duì)不易產(chǎn)生分子污染，可作為ASFV的診斷、檢疫、食品安全檢驗(yàn)和ASFV分子生物學(xué)研究的一種定量檢測(cè)方法。

Haines F J等［16］和陳靜靜等［17］分別建立了可以同時(shí)檢測(cè)CSFV和ASFV的熒光定量PCR鑒別檢測(cè)方法，檢測(cè)口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水皰病病毒、豬圓環(huán)病毒2型均為陰性，靈敏度可以達(dá)到10拷貝的數(shù)量級(jí)，對(duì)2份已知CSFV陽(yáng)性血清樣品和120份豬內(nèi)臟、豬鼻腔拭子及血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，未知樣品檢出CSFV 3份陽(yáng)性，未檢出ASFV陽(yáng)性。CSFV和ASFV雙重?zé)晒舛縋CR鑒別檢測(cè)方法，只需一步操作即可完成CSFV和ASFV的鑒別診斷，且敏感性比常規(guī)的CSFV和ASFV雙重PCR鑒別檢測(cè)方法要高，適用于ASFV和CSFV的臨床快速鑒別診斷和定量檢測(cè)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)等溫條件下的核酸快速擴(kuò)增，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速，且不需要特殊儀器設(shè)備，具有較高的臨床實(shí)用性。James H E等［18］和江彥增等［19］均建立了快速、高效檢測(cè)ASFV的LAMP方法，該方法在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，30min即可得到結(jié)果，靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍以上，非常適合在野外現(xiàn)場(chǎng)或缺乏試驗(yàn)條件的邊遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)ASFV。楊吉飛等［20］利用建立的ASFV的LAMP方法對(duì)非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供的ASFV 17個(gè)毒株的基因組以及國(guó)內(nèi)收集的50份豬的基因組、30份蜱的基因組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示LAMP方法能夠成功擴(kuò)增非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株的基因組，而野外收集的豬和蜱的基因組檢測(cè)均為陰性。LAMP檢測(cè)方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可進(jìn)行靶序列的循環(huán)擴(kuò)增，不但大大縮短了時(shí)間，且使反應(yīng)能夠在恒溫條件下進(jìn)行，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，肉眼判讀，可以滿足基層快速診斷的需要，非常適合于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)使用。

4 探針雜交技術(shù)

探針技術(shù)是用探針標(biāo)記已知核酸序列，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記探針信號(hào)而分析核酸含量，進(jìn)而可用于特定基因序列的檢測(cè)。張?chǎng)斡畹龋?1］針對(duì)ASFV p72基因分別設(shè)計(jì)合成1條與保守區(qū)域互補(bǔ)的5′生物素標(biāo)記及3′烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標(biāo)記探針，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素探針及納米金標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入吸附鏈霉親和素的酶標(biāo)板，利用親和原理，捕獲雜交產(chǎn)物，銀染增強(qiáng)法對(duì)納米金標(biāo)記探針進(jìn)行信號(hào)放大，進(jìn)而建立了檢測(cè)ASFV p72基因的納米金探針雜交方法。該方法中納米金探針經(jīng)銀染放大后，在酶標(biāo)板中形成肉眼可見(jiàn)的黑色沉淀，可有效檢測(cè)擴(kuò)增出核酸濃度達(dá)到10fmol/L p72基因，可用于ASFV快速檢測(cè)。探針技術(shù)檢測(cè)靈敏度高，同時(shí)能有效排除PCR檢測(cè)過(guò)程中的非特異性結(jié)果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，在酶標(biāo)板中可以批量反應(yīng)，為ASFV核酸檢測(cè)方法研究開(kāi)辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高，操作較繁瑣，對(duì)試驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高。

5 ELISA方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是繼免疫熒光和放射性同位素免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫酶技術(shù)，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、無(wú)輻射、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前動(dòng)物疫病診斷與流行病學(xué)調(diào)查廣泛采用的免疫學(xué)診斷技術(shù)。Perez Filgueira D M等［22］以昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的p30重組蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)ASFV抗體的間接ELISA方法，通過(guò)對(duì)采自西班牙和不同非洲地區(qū)的672份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)表明，間接ELISA方法敏感性高，可檢測(cè)到ASFV早期感染的樣品，可用于ASFV特異性抗體的早期檢測(cè)。董志珍等［23］利用基因重組技術(shù)制備非洲豬瘟p54蛋白，將其免疫Balb/c小鼠，將免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗ASFV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，使用該單克隆抗體建立了檢測(cè)豬血清中ASFV抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，該方法靈敏度高于間接免疫熒光方法，可用于豬血清的ASFV抗體檢測(cè)。曾少靈等［24］利用桿狀病毒表達(dá)載體成功表達(dá)了ASFV VP73蛋白，表達(dá)的重組蛋白具有良好的特異性與反應(yīng)性，以此重組蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了檢測(cè)ASFV血清抗體的間接ELISA方法。張倩等［25］采用瑞典SVANOVA非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)遼寧綏靖、內(nèi)蒙古赤峰、大連東港共計(jì)92份豬血清進(jìn)行了ASFV抗體的檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性。ELISA方法高通量、快速、簡(jiǎn)單、敏感、特異、無(wú)污染，非常適用于基層獸醫(yī)部門進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

6 小結(jié)

非洲豬瘟在我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)，是我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易中監(jiān)測(cè)的重要疫病，必須保持高度警惕，防止該病入境。近年來(lái)，隨著國(guó)際貿(mào)易、現(xiàn)代物流的飛速發(fā)展、世界經(jīng)濟(jì)的全球化、自然生態(tài)環(huán)境的改變，ASFV從西非至東非、歐洲、亞洲傳播的態(tài)勢(shì)已經(jīng)形成，傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)加劇，加強(qiáng)該病診斷技術(shù)的研究貯備工作具有重要意義。目前，針對(duì)ASFV的檢測(cè)技術(shù)主要有針對(duì)病毒核酸檢測(cè)技術(shù)和基于病毒抗原/抗體反應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù)。用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，但抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測(cè)方法存在一定的局限性。PCR、熒光定量PCR、LAMP等分子生物學(xué)技術(shù)在豬感染ASFVV的早期即可檢測(cè)到病毒核酸，在ASFV的早期檢測(cè)中具有重要作用。其中PCR方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好，需要一定的儀器設(shè)備和試劑，適合一般實(shí)驗(yàn)室使用。熒光定量PCR方法將PCR與熒光檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，克服了常規(guī)PCR易污染、擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)等缺點(diǎn)，并可對(duì)病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，且檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR方法更高，但熒光定量PCR方法對(duì)操作人員、儀器設(shè)備與試劑要求較高，一般實(shí)驗(yàn)室很難具備試驗(yàn)條件，難以普及應(yīng)用。LAMP方法肉眼判讀、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊儀器設(shè)備，特別適合于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用。總之，ASFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但對(duì)各種方法的檢測(cè)結(jié)果均要求準(zhǔn)確、快速、敏感，以便采取及時(shí)、有效的防控措施。相信隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，ASFV實(shí)驗(yàn)室診斷方法必將會(huì)不斷完善，進(jìn)一步為我國(guó)開(kāi)展非洲豬瘟的監(jiān)測(cè)與綜合防控提供技術(shù)支持。

［1］Gabriel C，Blome S，Malogolovkin A，et al.Characterization of African swine fever virus Caucasus isolate in European wild boars［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（12）：2342-2345.

［2］Oganesyan A S，Petrova O N，Korennoy F I，et al.African swine fever in the Russian Federation：spatio-temporal analysis and epidemiological overview［J］.Virus Res，2013，173（1）：204-211.

［3］Blome S，Gabriel C，Dietze K ，et al.High virulence of African swine fever virus caucasus isolate in European wild boars of all ages［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（4）：708.

［4］Oura C.African swine fever virus：on the move and dangerous［J］.Vet Rec，2013，173（10）：243-245.

［5］Costard S，Mur L，Lubroth J，et al.Epidemiology of African swine fever virus［J］.Virus Res，2013，173（1）：191-197.

［6］Gogin A，Gerasimov V，Malogolovkin A，et al.African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012［J］.Virus Res，2013，173（1）：198-203.

［7］包靜月，王志亮.非洲豬瘟流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，30（6）：72-76.

［8］Aguero M，F(xiàn)ernandez J，Romero L，et al.Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples［J］.J Clin Microbiol.2003，41（9）：4431-4434.

［9］曾少靈，花群義，張彩虹，等.非洲豬瘟病毒PCR檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（10）：6-10.

［10］楊 霞，陳 陸，孫彥婷，等.河南省非洲豬瘟感染情況篩查［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（21）：1-5.

［11］Aguero M，F(xiàn)ernandez J，Romero L J，et al.A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and classical swine fever in clinical samples［J］.Vet Res，2004，35（5）：551-563.

［12］張 倩，劉明團(tuán).非洲豬瘟與豬瘟雙重PCR方法的建立與初步應(yīng)用［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2012，33（11）：7-9.

［13］Fernandez Pinero J，Gallardo C，Elizalde M.Molecular diagnosis of African swine fever by a new real-time PCR using universal probe library［J］.Transbound Emerg Dis，2013，60（1）：48-58.

［14］黃 萍，肖家勇，歐陽(yáng)振宇.非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010，27（11）：28-30.

［15］郭少平，劉 建，吳紹強(qiáng).非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的研究與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：76-80.

［16］Haines F J，Hofmann M A，King D P，et al.Development and validation of a multiplex，real-time RT PCR assay for the simultaneous detection of classical and African swine fever viruses［J］.PLoS One，2013，8（7）：e71019.

［17］陳靜靜，羅寶正，沙才華.多重?zé)晒釶CR鑒別診斷豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2012，9（2）：4-6.

［18］James H E，Ebert K，McGonigle R.Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification［J］.J Virol Meth，2010；164（1-2）：68-74.

［19］江彥增，朱鴻飛.非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（2）：72-74.

［20］楊吉飛，關(guān)貴全，劉志杰.非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2011，19（4）：7-12.

［21］張?chǎng)斡?，孫懷昌，劉文俊，等.非洲豬瘟病毒p72基因的納米金探針研究［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2011，32（1）：55-58.

［22］Perez Filgueira D M，Gonzalez-Camacho F，Gallardo C，et al.Optimization and validation of recombinant serological tests for African swine fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae［J］.J Clin Microbiol，2006，44（9）：3114-3121.

［23］董志珍，肖 妍，趙祥平，等.檢測(cè)非洲豬瘟McAb-ELISA競(jìng)爭(zhēng)試劑盒的建立及初步應(yīng)用［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29（4）：37-40.

［24］曾少靈，廖立珊，唐金明，等.非洲豬瘟病毒VP73蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)與間接ELISA方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（1）1：1-6.

［25］張 倩，劉明團(tuán)，任瑋杰.非洲豬瘟ELISA抗體檢測(cè)報(bào)告［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2012，28（11）：49.