一氧化氮在結核分支桿菌感染巨噬細胞中的作用研究進展

何玉龍，張文清，吳月紅

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏銀川750021）

結核?。═uberculosis，TB）是由結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的人獸共患慢性傳染病，全世界約有1/3的人感染MTB。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WTO）2012年估算，全世界共有860萬人罹患結核病，130萬人死于結核病。我國是結核病高發(fā)國家之一，其中肺結核病人總數(shù)居全球第2位，是全球22個肺結核高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥肺結核流行嚴重的國家之一［1］。因此，結核病不僅是我國重點控制的三大重大疾病之一，也是全球關注和亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題和社會問題。

巨噬細胞是固有免疫應答中最主要的細胞類型，在宿主防御細菌性病原體中發(fā)揮著關鍵的作用。一氧化氮（nitric oxide，NO）在肺響應感染和抑菌及殺菌的宿主防御過程中起重要作用［2］。其中巨噬細胞產(chǎn)生的 NO可以起到抑制微生物的作用［3］。MTB為典型的胞內寄生菌，侵染機體后主要被體內的巨噬細胞所吞噬，未被機體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的MTB也主要寄生于巨噬細胞內。MTB與其宿主巨噬細胞的相互作用對結核病的病理發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，許多細胞內外的信號分子已被證實參與了這一病原-宿主的相互作用過程。巨噬細胞可通過氧化殺菌機制產(chǎn)生NO等氧自由基殺死寄生于其內的 MTB，來阻止 MTB在體內的擴散，并能激活鄰近未感染的巨噬細胞，增強機體對MTB的殺傷能力［4］。研究表明，牛巨噬細胞產(chǎn)生的NO是抵御MTB感染的主要因素，而并不是巨噬細胞的凋亡［5］。因此，巨噬細胞產(chǎn)生NO的能力對于寄生于其中的MTB的命運至關重要。

鑒于NO在宿主防御過程中的重要作用，本文就NO在MTB感染宿主巨噬細胞過程中的作用進行綜述，以期為結核病的防控提供理論依據(jù)。

1 NO的產(chǎn)生和功能

NO是近年來發(fā)現(xiàn)的倍受關注的氣體性無機小分子，它參與人體多種生理和病理過程，是細胞間信息傳遞的重要調節(jié)因子。NO具有各種各樣的作用，取決于其相對濃度以及生成的環(huán)境。尤其在免疫應答中NO發(fā)揮了多種功能，包括控制感染，以及參與調控信號級聯(lián)反應、轉錄因子、血管反應、白細胞滾動、遷移、細胞因子生成和T細胞分化［6-7］。而且巨噬細胞產(chǎn)生的NO對所吞噬的腫瘤細胞和微生物等具有直接的細胞毒性作用［8］。在激活的巨噬細胞內，通過誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）催化生成NO。生成的NO與·O2-結合后進一步氧化成·NO2-和·NO3-。NO、·NO2-和·NO3-等共同構成具有殺菌活性的活性氮中介物（reactive nitrogen intermediate，RNI）。NO和RNI可以對抗或殺死包括MTB在內的多種入侵的病原體［9］，是對抗病原體的一個最有效的分子殺菌方式。因此，NO被認為是宿主防御的基本介質。

體內在還原型輔酶Ⅱ（NADPH）或四氫生物喋呤（tetrahydrobiopterin）存在條件下，一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）催化L-精氨酸與氧分子反應，生成 L-胍氨酸和 NO［10］。iNOS在許多種細胞因子、LPS和微生物誘導時均能產(chǎn)生大量的NO。產(chǎn)生的NO作用于微生物的關鍵代謝酶，使其失活而發(fā)揮抗微生物的作用［11］?；钚詉NOS誘導產(chǎn)生的低濃度NO（在μmol/L范圍內），具有抗菌、抗動脈粥樣硬化或凋亡作用［12］。但過高濃度的NO也會加重炎癥反應，導致組織損傷［13］。因此，在炎癥反應過程中，必須有嚴格機制控制iNOS的表達，從而保持適當濃度的NO產(chǎn)生。

2 NO在抵御MTB感染中的作用研究

小鼠中NO不僅在抵抗MTB的防御反應中起重要作用，通過使用L-單甲基-精氨酸（L-NG-monomethyl-arginine，L-NMMA）等NOS抑制劑或iNOS基因敲除小鼠研究證明，NO在百日咳鮑特菌［14］、傷寒沙門菌［15］及柯薩奇病毒、人類皰疹病毒和單純性皰疹病毒（HSV-1）［16］等感染中表現(xiàn)出抗菌或抗病毒活性。另外，經(jīng)細胞因子或LPS刺激巨噬細胞大量表達iNOS后產(chǎn)生的NO對球蟲、弓形蟲、錐蟲、瘧原蟲、肝片吸蟲、血吸蟲等寄生蟲也有殺傷作用［17］。NO除直接殺傷入侵的 MTB等病原微生物外，其介導的細胞凋亡是激活的巨噬細胞對抗MTB的另一種防御機制［18］。

2.1 在小鼠上的研究

MTB感染小鼠宿主巨噬細胞后，通過iNOS產(chǎn)生的NO可以有效殺滅或抑制包括有毒株（Erdman）在內的MTB的生長。感染MTB后的小鼠使用氨基胍和L-NMMA兩個不同的iNOS抑制劑后發(fā)現(xiàn)，在小鼠死亡率、細菌負擔、病理組織損傷等方面呈現(xiàn)出類似的毒害效應，說明NO在對抗MTB中有重要的作用［19］。此外，NO還能通過抑制呼吸作用誘導MTB的休眠程序［20］。用實驗室和臨床分離株兩種不同來源的MTB感染iNOS（即NOS2）缺失的小鼠（NOS2-/-）后，發(fā)現(xiàn) NOS2-/-的小鼠更易感染 MTB［21］。Olin M R等［22］利用iNOS基因敲除的小鼠（iNOS-/-）研究了NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御MTB感染中的作用，發(fā)現(xiàn)MTB感染iNOS缺失（iNOS-/-）的小鼠，出現(xiàn)嚴重的臨床表現(xiàn)和肉芽腫病變（包括MTB遍布整個腦膜），類似于人體結核性腦膜炎表現(xiàn)。但這些病理表現(xiàn)在MTB感染的野生型小鼠中未出現(xiàn)，據(jù)此進一步證實NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御MTB中也起重要的作用。

2.2 在人體的研究

NO是否在人類宿主防御MTB過程中也起關鍵作用尚存爭議。盡管證實人類肺泡巨噬細胞早期抑制MTB生長不依賴于NO的抗菌機制，但這并不能排除NO在人的宿主防御機制中的作用［16］。越來越多的證據(jù)表明包括卡介苗（BCG）在內的MTB感染人類單核細胞/巨噬細胞、肺泡巨噬細胞系和上皮細胞內均能引起iNOS的表達，并催化產(chǎn)生NO對抗或殺死 MTB［9］。包括L-NMMA在內的4種不同的iNOS酶抑制劑可以抑制MTB誘導的NO產(chǎn)生，抑制NO產(chǎn)生后造成2個臨床分離株MTB在細胞內生長的增加。而利用供體（S-亞硝基-N-乙酰青霉胺）釋放的NO對肉湯培養(yǎng)基中相同菌株也有直接抑制作用。菌落檢測和使用LNMMA也證明弱毒株BCG誘導產(chǎn)生的NO及其與氧自由基反應的產(chǎn)物過氧亞硝酸鹽在殺滅人肺泡巨噬細胞中BCG發(fā)揮重要作用［16］。

近年來在人體的研究也證明NO對結核病的發(fā)生及發(fā)展有重要的調控作用。與健康對照組相比結核病患者呼出氣體中的NO濃度和尿中NO代謝物濃度較低［23］。Ralph A P等［24］研究發(fā)現(xiàn)，與88名對照者相比，200名肺結核患者的呼吸氣NO（Fractional exhaled NO，F(xiàn)ENO）在肺結核確診的時候水平較低，在治療初始時更低（1周時最低），而在治療6個月后恢復。說明NO在人類結核病發(fā)病過程中有重要的作用，并提示呼吸氣NO的降低不利于結核病的治療，即增加肺NO的水平對結核病的治療有輔助作用［24-25］。

3 NO與細胞因子的相互作用

多種細胞因子均可調節(jié)NO的合成，如LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6 和 MIF 都 可 誘 導iNOS表達并產(chǎn)生NO；而另外一些細胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10 等則抑制 NO 的生成［26-28］。有報告顯示，與健康對照相比結核病患者肺泡巨噬細胞中NO生成的增加對TNF-α和IL-1β炎性細胞因子合成起調節(jié)作用［12，29］。推測可能的機制是產(chǎn)生的NO促進TNF-α和IL-1β的分泌，隨后又通過反饋回路影響NO產(chǎn)生［12］。此外，NO調節(jié)活動性結核病患者外周血單核細胞釋放 TNF-α，反之亦然［29］。MTB感染后會通過NLRP3炎性體引起有害促炎細胞因子IL-1的產(chǎn)生，但NO能通過硫醇亞硝基化作用特異性抑制NLRP3炎性體的組裝，從而抑制NLRP3炎性體依賴的IL-1加工過程控制結核?。?0］。

4 結語

結核病是一種古老的疾病，自20世紀90年代，由于多重耐藥結核菌（MDR-TB）的流行、人類免疫缺陷病毒（HIV）的感染及貧窮等多種因素的影響，全球結核病發(fā)病率呈日益回升的趨勢。MTB致病、耐藥機制及機體對MTB的免疫清除機制的研究，為研制新型診斷試劑、抗結核藥物和結核病新疫苗等工作奠定基礎。

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