HBV母嬰垂直傳播相關(guān)影響因素研究

牛兆儀 王芳 靳晴 顧玨 余霞 初正敏 李碧霞 李麗榮

昆明市延安醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南昆明 650051

HBV母嬰垂直傳播相關(guān)影響因素研究

牛兆儀 王芳 靳晴 顧玨 余霞 初正敏 李碧霞 李麗榮

昆明市延安醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南昆明 650051

目的 探討妊娠合并HBV感染的孕婦母嬰垂直傳播的相關(guān)影響因素。方法 收集100例乙肝病毒攜帶孕婦及其100例新生兒作為研究對(duì)象，采用雙抗體夾心時(shí)間分辨免疫熒光法（IFMA法）檢測(cè)孕婦HBsAg和HBeAg，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA載量，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)新生兒臍血中NK細(xì)胞CD69和IFN-γ，并對(duì)以上指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果母血中HBsAg單陽(yáng)性與HBsAg/HBeAg雙陽(yáng)性組間母嬰垂直傳播比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；孕婦外周血HBV DNA載量越高母嬰垂直傳播幾率越高。妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母嬰垂直傳播組、未發(fā)生HBV母嬰垂直傳播患者與正常對(duì)照組三組間臍血中 T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比分別為：（9.58±1.745）%、（15.6±2.117）%和（5.66±3.724）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HBV母嬰垂直傳播與IFN-γ無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。 結(jié)論 母血HBeAg陽(yáng)性與否、HBV DNA病毒載量高低直接決定著母嬰HBV垂直傳遞的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)水平與母嬰HBV垂直傳播相關(guān)，該研究的結(jié)果為臨床研究HBV母嬰傳播的機(jī)理及其預(yù)防措施，減少HBV攜帶者，提高新生兒出生質(zhì)量有重要意義。

HBV感染；母嬰垂直傳播；影響因素

我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，母嬰傳播是乙型肝炎病毒（HBV）傳播的一條重要途徑，亞洲HBV感染者中有30%～50%是通過(guò)母嬰傳播形成的，我國(guó)每年約26萬(wàn)新生兒通過(guò)母嬰傳播途徑感染HBV[1]，阻止母嬰傳播是控制乙肝流行的主要環(huán)節(jié)。大量的研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在HBV感染早期的病毒清除和慢性HBV感染患者肝臟病變過(guò)程中都起到了十分重要的作用，但關(guān)于NK細(xì)胞在HBV母嬰傳播中的作用并不清楚，因此，該研究檢測(cè)妊娠合并HBV感染的孕婦及其新生兒的外周血的HBsAg、HBeAg以及HBV DNA載量，并檢測(cè)臍血中NK細(xì)胞表面IFN-γ和CD69的表達(dá)水平，以探討NK細(xì)胞在HBV在母嬰傳播中的作用。報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2009年1月—2013年12月在云南省昆明市延安醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶孕婦共計(jì)100例（母血中HBsAg單陽(yáng)性、HBsAg/HBeAg雙陽(yáng)性）及其新生兒100例作為研究對(duì)象。所選病例孕期均無(wú)先兆流產(chǎn)或先兆早產(chǎn)及妊娠期高血壓病史以及無(wú)其他原發(fā)性疾病，肝功能正常，孕期未使用其他研究藥物或全身抗病毒、細(xì)胞毒性、類固醇激素或免疫調(diào)節(jié)劑等藥物。另外，收集同期就診的乙型肝炎病毒攜帶隱性的健康孕婦分娩的新生兒臍血40例作為正常對(duì)照，其中病例組與正常對(duì)照組間分娩時(shí)胎齡均在36～41周之間，分娩方式均按正常待產(chǎn)擬定治療方案，兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 孕婦分娩前采集靜脈血3 mL，分兩份分離血清，分別進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)和乙型肝炎5項(xiàng)檢測(cè)。新生兒于分娩時(shí)在碘伏消毒過(guò)的臍帶處采集臍血5 mL，分離血清做HBV DNA檢測(cè)，分娩12 h內(nèi)采集橈動(dòng)脈血，分離血清儲(chǔ)存于-20℃中保存待測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法 ①乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）采用雙抗體夾心時(shí)間分辨免疫熒光法（IFMA法）：采用WALLAC公司1235全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀對(duì)妊娠合并乙型肝炎患者、新生兒、新生兒臍帶血進(jìn)行乙肝兩對(duì)半定量檢測(cè)。②HBV DNA定量檢測(cè)采用熒光定量PCR法（美國(guó)Bio-Rad公司的DA7600型核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)及上海夏華生物醫(yī)學(xué)工程有限公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒），分別設(shè)計(jì)一堆乙型肝炎病毒特異性引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，用PCR體外擴(kuò)增發(fā)定量檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA，標(biāo)本的HBV DNA含量以copies/ml表示。③新生兒臍血中NK細(xì)胞CD69和IFN-γ采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司的FACS-Calibur流式細(xì)胞儀）檢測(cè)，取 CD3、CD56和CD69抗體（Biolegend公司提供）各5 μL和100 μL血樣混勻避光孵育20 min，然后加入1 mL溶血素混勻作用5 min，離心棄上清后加入1M1×LPBS，再離心并棄上清，加入200 μL 1×LPBS上機(jī)檢測(cè)。

1.3 新生兒HBV感染的判定標(biāo)準(zhǔn)

HBV感染判定標(biāo)準(zhǔn)新生兒外周血HBsAg陽(yáng)性和/或HBV DNA陽(yáng)性判定為HBV感染存在。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用四格表確切概率法及χ2檢驗(yàn)比較組間差異。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 母血中HBsAg、HBeAg與HBV母嬰垂直傳播的關(guān)系

ELISA法檢測(cè)100例妊娠合并乙型肝炎病毒感染的孕婦，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）單陽(yáng)性發(fā)生母嬰垂直傳播率為1.75%；乙肝表面抗原及e抗原（HBsAg/HBeAg）雙陽(yáng)性患者發(fā)生母嬰垂直傳播率為46.51%，患兒橈動(dòng)脈血乙肝兩對(duì)半檢測(cè)為HBsAg或HBeAg陽(yáng)性，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，見(jiàn)表1。（HBsAg正常值0～0.2 ng/mL、HBeAg正常值0～0.5 PEIU/mL）。母血中HBsAg單陽(yáng)性與HBsAg/HBeAg雙陽(yáng)性其發(fā)生HBV母嬰垂直傳播率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），可認(rèn)為母血中HBsAg單陽(yáng)性與HB-sAg/HBeAg雙陽(yáng)性與發(fā)生HBV母嬰垂直傳播有相關(guān)性。

表1 母血中HBsAg、HBeAg與HBV母嬰垂直傳播的關(guān)系

2.2 母血外周血HBV DNA病毒載量與HBV母嬰垂直傳播的關(guān)系

產(chǎn)婦外周血HBV DNA按病毒載量由低到高分為3組：HBV DNA≤105 copies/mL、105 copies/mL＜HBV DNA＜106 copies/mL、HBV DNA≥106 copies/mL，這3組產(chǎn)婦分娩的新生兒分別有56例、4例和40例，相應(yīng)的新生兒橈動(dòng)脈血HBV DNA陽(yáng)性率分別為0%（0/56）、25%（1/4）、50%（25/50）。孕婦外周血HBV DNA載量越高，其新生兒HBV DNA陽(yáng)性率越高，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表2。

表2 不同母血外周血HBV DNA載量所生嬰兒感染率的比較

2.3 新生兒臍血NK細(xì)胞表面IFN-γ和CD69表達(dá)水平與HBV母嬰垂直傳播的關(guān)系

妊娠合并乙型肝炎患者中HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物 CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比為（9.58± 1.745）%，未發(fā)生HBV母嬰垂直傳播患者臍血中T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比為（15.6±2.117）%；正常對(duì)照組為（5.66±3.724）%，3組間T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖1?？烧J(rèn)為HBV母嬰垂直傳播與CD69表達(dá)具有相關(guān)性。而IFN-γ的表達(dá)在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的比較

3 討論

發(fā)生HBV母嬰垂直傳播有3種可能的途徑：產(chǎn)前傳播、產(chǎn)時(shí)傳播和產(chǎn)后感染，目前普遍認(rèn)為分娩過(guò)程中的HBV感染是圍產(chǎn)期感染的主要途徑。HBV宮內(nèi)感染難以阻斷，并且是新生兒HBV感染的主要途徑。

該研究結(jié)果顯示，HBV母嬰垂直傳播與母血中HBsAg單陽(yáng)性與HBsAg/HBeAg雙陽(yáng)性，母嬰垂直傳播比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），許多研究也得到與該研究相同的結(jié)論，新生兒HBV感染和母親血清中e抗原陽(yáng)性明顯相關(guān)[2]。乙型肝炎e抗原是存在于病毒顆粒之外的一種可溶性蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg能夠通過(guò)胎盤(pán)，引起胎兒對(duì)HBeAg的T細(xì)胞耐受，從而導(dǎo)致免疫功能低下，在這種情況下，暴露于高濃度母血HBV的胎兒就更容易被感染。因此，HBeAg不僅僅是高傳染性的標(biāo)志，其本身也可能通過(guò)影響胎兒免疫系統(tǒng)，從而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)HBV宮內(nèi)感染主要在孕晚期經(jīng)胎盤(pán)感染胎兒，隨著孕婦血清HBV DNA水平增高，胎兒發(fā)生宮內(nèi)感染的危險(xiǎn)性呈增高趨勢(shì)[6]。當(dāng)孕婦血清中HBV DNA水平＞108拷貝/mL時(shí)，即使采用產(chǎn)后雙重免疫宮內(nèi)感染仍可達(dá)43%左右[6]，而母血中HBV DNA水平在106拷貝/mL以下時(shí)，將減少30%的HBV宮內(nèi)感染母嬰垂直傳播危險(xiǎn)[7]。該研究結(jié)果顯示，隨孕婦外周血HBV DNA病毒載量水平增高，胎兒發(fā)生HBV母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)呈增高趨勢(shì)：妊娠合并乙型肝炎患者外周血HBV DNA病毒載量＜105 copies/mL的患者未發(fā)現(xiàn)母嬰垂直傳播；母血HBV DNA病毒載量大于105 copies/mL的產(chǎn)婦可能母嬰傳播，尤其是母血HBV DNA病毒載量＞106 copies/ mL的產(chǎn)婦，50%發(fā)生母嬰HBV傳播。因此，HBV DNA是反映HBV攜帶者傳染性的直接指標(biāo)，孕婦血清HBV DNA水平確實(shí)與母嬰HBV傳播有關(guān)，且母血HBV DNA高載量（≥106 copies/ mL）可能是HBV母嬰傳播的高危因素。

CD69被稱為早期激活抗原或活化誘導(dǎo)分子，是表達(dá)經(jīng)抗原刺激后各種激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性和嗜酸粒細(xì)胞、胸腺細(xì)胞表面，當(dāng)其表達(dá)后，可作為共刺激信號(hào)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖。Goncalves等[8]通過(guò)對(duì)HBV疫苗的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞CD69表達(dá)與HBV感染關(guān)系密切，認(rèn)為T(mén)細(xì)胞CD69表達(dá)的降低是機(jī)體對(duì)HBV無(wú)反應(yīng)的結(jié)果。該研究發(fā)現(xiàn)，健康產(chǎn)婦組的臍血T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比處于低水平（5.66%），而妊娠合并乙型肝炎患者發(fā)生母嬰HBV垂直傳播組和未發(fā)生HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比高于正常對(duì)照組，特別是妊娠合并乙型肝炎患者未發(fā)生HBV母嬰垂直傳播組臍血中T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比（15.6%）顯著高于垂直傳播組（9.58%）?？梢?jiàn)，CD69的表達(dá)與HBV母嬰垂直傳播有相關(guān)性。T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)的細(xì)胞百分比的升高有利于機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的清除，從而降低HBV母嬰垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

IFN-γ主要由活化的NK細(xì)胞和Th細(xì)胞產(chǎn)生，其生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ分子，活化單核、巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其溶菌活性及分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,也是促進(jìn)T細(xì)胞分化和CD8+CTLs成熟的重要因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制肝炎病毒，同時(shí)IFN-γ誘導(dǎo)及活化NK細(xì)胞，又能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)機(jī)體的防御能力。NK細(xì)胞IFN-γ表達(dá)量的增加可能在HBV清除中起到十分重要的作用[10]。該研究結(jié)果顯示，妊娠合并乙肝病毒感染的孕婦發(fā)生HBV垂直傳播組、非垂直傳播組和正常對(duì)照組NK細(xì)胞表面IFN-γ表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此IFN-γ表達(dá)與HBV母嬰垂直傳播的相關(guān)性有待進(jìn)一步的研究。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)母血HBeAg陽(yáng)性與否、HBV DNA病毒載量高低直接決定著母嬰HBV垂直傳遞的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)T淋巴細(xì)胞中活化標(biāo)志物CD69表達(dá)水平與母嬰HBV垂直傳播相關(guān)，該研究的結(jié)果為臨床研究HBV母嬰傳播的機(jī)理及其預(yù)防措施，減少HBV攜帶者，提高新生兒出生質(zhì)量有重要意義。

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·編讀往來(lái)·

論文寫(xiě)作技巧——題名

1.題名應(yīng)以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)明的詞語(yǔ)反映文章中最重要的特定內(nèi)容。一般使用能充分反映論文主題內(nèi)容的短語(yǔ)，不使用具有主、謂、賓結(jié)構(gòu)的完整語(yǔ)句。一般不設(shè)副題名。一般不超過(guò)20字。

2.題名應(yīng)盡量避免使用非公知公認(rèn)的縮略語(yǔ)、字符、代號(hào)等，也不應(yīng)將原形詞和縮略語(yǔ)同時(shí)列出。

3.英文題名應(yīng)與中文題名含義一致。

4.題名轉(zhuǎn)行應(yīng)保持詞語(yǔ)的完整。完整的詞拆開(kāi)轉(zhuǎn)行，虛詞（例如"的"字）應(yīng)盡可能留在行末，而連接詞（例如“和”、“與”、“及其”等）不宜留在行末。

Study on the Influencing Factors Related to Mother-to-child Vertical Transmission of HBV

NIU Zhaoyi WANG Fang JIN Qing GU Jue YU Xia CHU Zhengmin LI Bixia LI Lirong
Obstetrics and Gynecology Department,Yan'an Hospital of Kunming City,Kunming,Yunnan Province,650051,China

Objective To investigate the influencing factors related to mother-to-child vertical transmission of hepatitis B virus infection.Methods 100 cases of hepatitis B virus carrying pregnant women and their 100 newborns were selected as the research object.HBsAg and HBeAg of the pregnant women were detected by IFMA method,and HBV DNA load of them was detected by real-time PCR.NK cells CD69 and IFN-γ in the umbilical cord blood of the newborns were detected by flow cytometry.And the relativity between the above indexes was analyzed statistically.Results The difference in the ratio of mother-to-child vertical transmission of HBV between the pregnant women with positive HBsAg and those with double positive HBsAg/HBeAg was statistically significant(P＜0.001).The higher HBV DNA load in the maternal blood,the higher HBV mother-to-child vertical transmission ratio would be.T lymphocyte activation marker CD69 expression levels in the hepatitis group with mother-to-child vertical transmission of HBV,hepatitis group without mother-to-child vertical transmission of HBV,and the normal control group was(9.58± 1.745)%,(15.6±2.117)%,(5.66±3.724)%,respectively,the difference was statistically significant(P＜0.001).And mother-to-child vertical transmission of HBV had no significant relativity with IFN-γ(P＞0.05).Conclusion Positive HBeAg and HBV DNA load in the maternal blood are associated with the risk of mother-to-child vertical transmission of HBV.And T lymphocyte activation marker CD69 expression levels are related to mother-to-child vertical transmission of HBV.The results of this study are about the mechanism and preventive measures of mother-to-child vertical transmission of HBV clinically,which are of great significance in reducing the HBV carriers and improving the quality of neonates.

Hepatitis B virus infection;Mother-to-child vertical transmission;Influencing factor

R4

A

1674-0742（2014）10（a）－0044-03

2014-06-24）

云南省科技廳科研基金（2009CD128）。

牛兆儀(1961,7-),女,云南昆明人,本科,主任醫(yī)師,研究方向:產(chǎn)科疑難病診療。

王芳(1972,4-),女,云南昆明人,本科,副主任醫(yī)師,研究方向:婦產(chǎn)科。