自體DC CIK NK αβT γδT細(xì)胞治療乳腺組織細(xì)胞肉瘤的臨床研究

王銘棟 孟繁明 李紅姬 楊 麗

（吉林省吉林市中心醫(yī)院腫瘤科，132000）

自體DC CIK NK αβT γδT細(xì)胞治療乳腺組織細(xì)胞肉瘤的臨床研究

王銘棟 孟繁明 李紅姬 楊 麗

（吉林省吉林市中心醫(yī)院腫瘤科，132000）

目的 觀察細(xì)胞因子誘導(dǎo)的自體DC、CIK、NK、αβT、γδT細(xì)胞治療組織細(xì)胞肉瘤療效。方法 抽取患者自體外周血60～100 mL，采用血細(xì)胞分離機(jī)收集其單核細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)并擴(kuò)增CIK、NK、αβT、γδT細(xì)胞及DC細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀檢測其表型后，靜脈回輸CIK、NK、αβT、γδT細(xì)胞，皮下注射DC細(xì)胞，觀察組織細(xì)胞肉瘤變化。結(jié)果 患者左乳腫塊縮小＞50%，生活質(zhì)量明顯改善。結(jié)論 細(xì)胞免疫治療是一種化療后組織細(xì)胞肉瘤有效的治療手段，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

DC細(xì)胞；CIK細(xì)胞；NK細(xì)胞；T細(xì)胞；組織細(xì)胞肉瘤

組織細(xì)胞肉瘤是一類罕見的、造血系統(tǒng)起源的，形態(tài)學(xué)和免疫表型顯示為組織細(xì)胞分化的惡性腫瘤。乳腺組織細(xì)胞肉瘤更是十分罕見，目前無確切的治療方法。隨著免疫細(xì)胞生物學(xué)及免疫分子生物學(xué)的高速發(fā)展，細(xì)胞介導(dǎo)的過繼性免疫治療已成為腫瘤患者放化療后的輔助治療手段之一。其對于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)重建、消除殘留病灶及骨髓凈化具有良好的應(yīng)用效果。為了尋求一種安全、有效的治療方法，觀察自體免疫細(xì)胞治療乳腺組織細(xì)胞肉瘤1例。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 病例資料

患者女，51歲。因右乳腺癌保乳切除術(shù)后4年，并雙乳組織細(xì)胞肉瘤化療后8個月入院?；颊哂?009年診斷為右乳癌，在我院胸外科行右乳癌保乳切除術(shù)。術(shù)后病理示：右乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。術(shù)后行TA方案化療4周期。2011年6月，患者復(fù)查發(fā)現(xiàn)雙乳腫物；左乳腺結(jié)節(jié)伴皮疹，皮疹顏色鮮紅，無明顯瘙癢；腰背部、右上肢散在黃豆大小腫塊。之后于2011年7月就診于當(dāng)?shù)啬翅t(yī)院，行左乳腺外上象限切除術(shù)及右乳腺腫物及皮膚切除術(shù)。術(shù)后病理示：組織細(xì)胞肉瘤。行CHOP方案化療4周期。2011年12月，患者因腰背部、右上肢出現(xiàn)散在的皮膚腫物，腫物增大伴瘙癢及疼痛而來診。查體：體溫36.3℃，心率82次/min，呼吸20次/min，血壓140/90 mm Hg。腰背部及右上肢散在的皮膚腫物，顏色潮紅，質(zhì)硬；腰背部最大腫塊約5 cm ×5 cm。雙鎖骨上淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)未觸及腫大。雙乳腺見長20 cm切口瘢痕，愈合良好，左乳腺外側(cè)3點(diǎn)位置觸及3 cm×3 cm腫物，質(zhì)硬，無觸痛。雙肺呼吸音清；心律齊；肝脾未觸及；雙下肢無水腫。入院后血常規(guī)、肝功、腎功化驗(yàn)正常。頸部淋巴結(jié)彩超未見異常；上腹彩超示脂肪肝；泌尿系彩超未見異常；婦科彩超未見異常。乳腺鉬靶片示：左中乳見類圓形模糊淡片狀影，邊緣不清，雙乳皮膚及乳頭未見異常改變。胸部CT示：左乳下方見類圓形腫塊?？紤]患者病情進(jìn)展，給予3個療程細(xì)胞免疫治療。

2 免疫治療方法

2.1 治療過程 用血細(xì)胞分離機(jī)提取患者外周血60～100 mL，分離其中單個核細(xì)胞。在生物實(shí)驗(yàn)室中，將體外單個核細(xì)胞用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后（一般需要1～2周），獲得一群具有擴(kuò)增能力、腫瘤殺傷作用顯著、分泌細(xì)胞因子能力強(qiáng)的殺傷細(xì)胞（DC、CIK、NK、αβT、γδT細(xì)胞），再定期回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以發(fā)揮抗腫瘤作用。培養(yǎng)擴(kuò)增后的第7天，給患者皮下注射DC細(xì)胞，靜脈滴注αβT細(xì)胞；第14～19天分別回輸NK、CIK細(xì)胞，CIK、αβT細(xì)胞，NK、γδT細(xì)胞，NK、CIK細(xì)胞，CIK、αβT細(xì)胞，NK、αβT細(xì)胞。患者共接受3個療程的治療。

2.2 CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測 CIK細(xì)胞：采用FCS1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ mL，第1天加入rh-干擾素-γ 1 000 U/mL；第2天加入抗CD3單抗50 μg/mL、IL-1-α 100 U/mL、IL-2 1 000 U/mL，培養(yǎng)2 d。更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞數(shù)。DC細(xì)胞：進(jìn)行外周單個核細(xì)胞培養(yǎng)后，獲得貼壁單核細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基、GM-CFS 100 ng/mL、IL-4 500 U/mL。培養(yǎng)5 d后加入HSP復(fù)合物1 ng/mL，再培養(yǎng)6 d后收集懸浮的DC細(xì)胞[1]。

2.3 NK細(xì)胞培養(yǎng)及檢測 用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞[2]。將無菌塑料平皿用羊抗鼠IgG 1 mL（0.1 mg/mL）包被10 h。用含5% NCS2的生理鹽水洗3次。2×107個單核細(xì)胞中加入CD3單抗及CD8單抗200 μL，4℃孵育30 min。用含5% NCS2的生理鹽水洗3次，并重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×106/mL；加入包被的平皿中，4℃孵育40 min。收集非黏附的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞表面標(biāo)記的CD56及CD16分子。

2.4 γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測 選用固相抗體包被培養(yǎng)板，將分離的單個核細(xì)胞懸浮于FCS1640液體中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，分別加入抗TCRγδ和抗CD3包被的培養(yǎng)板中，再加如IL-2 15 μL（1×105U/mL），于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，更換液體1次/2 d。采用TCRγδ-FITC和抗TCRγδ-PE熒光標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫熒光雙染色，利用流式細(xì)胞儀分析所獲細(xì)胞群的純度[3]。

3 結(jié)果

患者第1個療程結(jié)束后，腰背部、右上肢散在的皮膚腫塊略縮小，縮小＜50%，瘙癢及疼痛癥狀消失，患者的生活質(zhì)量有所改善。第2個療程結(jié)束后，右上肢散在的皮膚腫塊消失，腰背部腫塊縮?。?0%，生活質(zhì)量明顯改善。第3個療程結(jié)束，后患者左乳腫塊縮小＞50%，腰背部腫塊消失。胸部CT復(fù)查結(jié)果見圖1～2。

圖1 治療前胸部CT

圖2 治療后胸部CT

4 討論

組織細(xì)胞肉瘤屬于侵襲性腫瘤，目前尚無統(tǒng)一的、療效確切的治療方案。組織細(xì)胞肉瘤發(fā)病過程雖然具有侵襲性特征，但部分患者發(fā)病時仍屬局限性疾病，因此腫瘤大小可能是一個關(guān)系到預(yù)后的因素[4]。目前，惡性腫瘤治療手段很多，包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)藥治療、熱療和射頻消融治療等，但都缺乏特異性和靶向性。

近年來，細(xì)胞介導(dǎo)的過繼免疫治療已成為腫瘤患者放化療后重要的輔助治療手段之一。在抗腫瘤的免疫效應(yīng)中，主要應(yīng)答為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫，T淋巴細(xì)胞包括αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞兩種亞型。αβT細(xì)胞主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫，需要DC細(xì)胞提呈抗原。由于腫瘤具有免疫逃逸機(jī)制，αβT細(xì)胞不能發(fā)揮有效的免疫應(yīng)答。γδT細(xì)胞主要存在于腸道、皮膚、舌、食管、氣管、肺和生殖系統(tǒng)的上皮細(xì)胞內(nèi)，占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的2%～5%，在腫瘤的先天性免疫監(jiān)視和后天性免疫治療中發(fā)揮著重要的作用[5]。DC細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞，可誘發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答，抗原提呈細(xì)胞功能降低使腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸。NK細(xì)胞不僅參與機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答，而且還通過釋放細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)[6]。CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等特點(diǎn)，對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感，能抵抗腫瘤細(xì)胞引起的效應(yīng)細(xì)胞Fas-FaxL凋亡。5種細(xì)胞協(xié)同應(yīng)用，能起到最大的效果。

本研究中，該患者化療效果有限，耐受性差，我們選擇細(xì)胞免疫治療方案。通過3個療程的治療，患者腫塊縮?。?0%，生活質(zhì)量明顯改善。而且免疫治療過程中，患者耐受性良好，未見不良反應(yīng)。

綜上所述，細(xì)胞免疫治療是一種化療后組織細(xì)胞肉瘤有效的治療手段，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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Clinical Research in the Treatment of Breast Tissue Cell Sarcoma with Autologous DC CIK NK αβT γδT Cells

WANG Mingdong MENG Fanming LI Hongji YANG Li
(The Department of Tumour, Jilin Central Hospital, Jilin 132000, China)

ObjectiveTo observe the clinical curative effect of cytokine induced autologous DC, CIK, NK, αβT and γδT cells to breast tissue cell sarcoma.MethodsThe mononuclear cells were separated from autologous peripheral blood in 60～100 mL by blood cell separator. The killer cells of CIK, NK, αβT, γδT and DC were induced and multiplied by cytokine in vitro. Flow cytometry was used to test their phenotype. CIK, NK, αβT, γδT cells were used by intravenous injection, and DC cells was used by subcutaneous injection.ResultsThe tumor of the patient reduced above 50%, and his life quality was improved signifi cantly.ConclusionCellular immunotherapy provides an effective approach for the treatment of tissue cell sarcoma after chemotherapy, which could provide new prospects in the clinical application.

DC cell; CIK cell; NK cell; T cell; tissue cell sarcoma.

1672-7185（2014）24-0060-03 doi∶10.3969/j.issn.1672-7185.2014.24.030

2014-09-09）

R737

A