細(xì)胞色素P450CYP3A65斑馬魚模型建立及對(duì)環(huán)境污染物的生物響應(yīng)

李春杰，趙 建，張世勇，潘微彤，蒲韻竹，賈啟燕，查曉丹，尚艷楠，黃春倩，劉艷琴，鐘玉緒，李 前，丁日高，付愛玲，趙寶全

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒理學(xué)與抗毒藥物研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院骨一科，內(nèi)蒙古通遼 028000)

細(xì)胞色素P450CYP3A65斑馬魚模型建立及對(duì)環(huán)境污染物的生物響應(yīng)

李春杰1，2，趙 建2，張世勇3，潘微彤2，蒲韻竹2，賈啟燕2，查曉丹2，尚艷楠2，黃春倩2，劉艷琴2，鐘玉緒2，李 前2，丁日高2，付愛玲1，趙寶全2

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒理學(xué)與抗毒藥物研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院骨一科，內(nèi)蒙古通遼 028000)

目的 建立細(xì)胞色素P450CYP3A65熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于快速、直觀檢測(cè)重金屬(銅、鎘、鋅)及類二噁英化合物五氯聯(lián)苯(PCB126)等環(huán)境污染物。方法 PCR方法釣取斑馬魚CYP3A65基因調(diào)控序列,構(gòu)建于pT2AL200R150G轉(zhuǎn)座載體克隆位點(diǎn),將pTol2-CYP3A65-EGFP質(zhì)粒與pCS-TP轉(zhuǎn)座酶mRNA共同注射入斑馬魚胚胎單細(xì)胞,通過熒光篩選,遺傳選育和建立熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg (CYP3A65-EGFP)；利用該轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎及幼魚檢測(cè)上述3種重金屬及PCB126的生物學(xué)響應(yīng)。結(jié)果 成功建立了CYP3A65熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系,綠色熒光在肝和消化道表達(dá)；該轉(zhuǎn)基因斑馬魚對(duì)3種重金屬及PCB126產(chǎn)生生物學(xué)響應(yīng)。染毒96 h后,銅0.1和0.2 μmol·L－1、鎘0.35和0.7 μmol·L－1組、鋅1.5和3 μmol·L－1組、PCB126所有濃度組熒光相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P＜0.01)；銅0.9 μmol·L－1組、鎘2.7和5.4 μmol·L－1組及鋅24 μmol·L－1組熒光相對(duì)表達(dá)量顯著減弱(P＜0.01)；染毒168 h后,銅0.1和0.2 μmol·L－1組、鎘0.35和0.7 μmol·L－1組、鋅1.5和3 μmol·L－1組及PCB126 2～32 μmol·L－1濃度組熒光相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P＜0.01),銅0.9 μmol·L－1組、鎘2.7和5.4 μmol·L－1組、鋅12和24 μmol·L－1組熒光相對(duì)表達(dá)量減弱(P＜0.05),隨著濃度增加熒光減弱,呈現(xiàn)出量效關(guān)系。結(jié)論 CYP3A65熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可以用來檢測(cè)銅、鎘、鋅及PCB126等環(huán)境污染物。

細(xì)胞色素P450 CYP3A65；斑馬魚,轉(zhuǎn)基因；銅；鎘；鋅；多氯聯(lián)苯化合物

細(xì)胞色素P450(cytochmme P-450，CYP450)是生物體內(nèi)含有多種超家族CYP450血紅蛋白或相同結(jié)構(gòu)域的酶系，對(duì)許多外源及內(nèi)源化合物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，污染物可誘導(dǎo)CYP450在mRNA、蛋白、酶活性水平上產(chǎn)生變化。細(xì)胞色素P450作為生物標(biāo)志物，其活性、蛋白含量和基因的表達(dá)已逐漸用于環(huán)境毒性檢測(cè)，通常表現(xiàn)為被外源污染物誘導(dǎo)或抑制而使其活性或蛋白及mRNA含量顯著增加或降低[1－4]。目前，魚類細(xì)胞色素CYP1A已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)的研究[5－8]。

CYP3A是動(dòng)物肝中含量最豐富的CYP450酶，參與大多數(shù)藥物或環(huán)境因子的生物轉(zhuǎn)化[9]。斑馬魚CYP3A65是CYP3A的直系同源物，主要在肝和小腸表達(dá)[10]。 Machala 等[11]證明魚類CYP3A可以被一些有機(jī)氯化合物及類二噁英化合物五氯聯(lián)苯(3，3′4，4′，5-pentachlorobiphenyl，PCB126)誘導(dǎo)，可作為環(huán)境毒性檢測(cè)的另一候選CYP450酶生物標(biāo)志物。利用斑馬魚胚胎和幼魚對(duì)有害物質(zhì)非常敏感的優(yōu)勢(shì)[12]，本實(shí)驗(yàn)利用pT2AL200R150G轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[13－14]建立斑馬魚CYP3A65基因調(diào)控的熒光標(biāo)記斑馬魚，通過觀察和定量斑馬魚CYP3A65基因調(diào)控序列調(diào)控綠色熒光蛋白(green fluorescein protein，GFP)基因表達(dá)情況，用于快速、直觀檢測(cè)環(huán)境重金屬離子及PCB126，為其作為生態(tài)及環(huán)境毒性的生物檢測(cè)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)；精密電子天平AEG-120(日本島津)；PCR儀(Bio-Rad)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；顯微注射儀X221942H(日本尼康)。PCB126純度大于98.5% (DrEhrenstorfer GmbH，德國(guó))；CuSO4、CdCl2、ZnSO4、二甲亞砜(DMSO)均為國(guó)產(chǎn)分析純；DNA Marker、基因組提取、凝膠回收、質(zhì)粒提取等常規(guī)分子生化試劑和試劑盒均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；XhoⅠ和BamHⅠ酶均購(gòu)于美國(guó)NEB公司；TOYOBO KOD FX酶購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；mMESSGE mMACHINE(SP6)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Ambion公司；pT2AL200R150G質(zhì)粒和pCS-TP質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院上海生科院神經(jīng)研究所杜久林研究員惠贈(zèng)；基因探針由賽百盛公司合成；基因測(cè)序由生工生物技術(shù)公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)生物

AB系成年斑馬魚由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，循環(huán)養(yǎng)殖水按照Brand等[15]的方法配制:毎1000 L去離子水中含碳酸氫鈉75 g，海鹽18 g和硫酸鈣8.4 g，水溫28～29℃，pH值7.2左右，總硬度62 mg·L－1(以CaCO3計(jì))，電導(dǎo)率485 μS，光照/黑暗周期為14 h∶10 h。斑馬魚胚胎由E3培養(yǎng)液培養(yǎng)，E3培養(yǎng)液亦按照他們的方法配制:每1000 L去離子水中含氯化鈉292.5 g、氯化鉀12.67 g、氯化鈣36.63 g和硫酸鎂39.6 g，并用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2左右，電導(dǎo)率600 μS，斑馬魚胚胎置于生化恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在(28.5±0.5)℃，光照/黑暗周期為14 h∶10 h。

1.3 CYP3A65熒光標(biāo)記斑馬魚的培育及表達(dá)分析

通過GenBank檢索斑馬魚CYP3A65基因調(diào)控序列(Gene ID 553969)，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，為了插入pT2AL200R150G載體，引入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，上游引物:5′-CCGCTCGAGGCCTGAGTGTTTGAAGTCTCCCT -3′；下游引物:5′-CGCGGATCCTGAAGATGATGAAGCTCAGACGG-3′。PCR反應(yīng)體系及條件依照TOYOBO KOD FX酶使用說明書進(jìn)行。構(gòu)建流程見圖1。PCR產(chǎn)物及pT2AL200R150G分別用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收啟動(dòng)子片段和載體片段，連接得到質(zhì)粒pTol2-CYP3A65-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced GFP，EGFP)。送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確(測(cè)序圖略)。Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA由pCS-TP通過mMESSGE mMACHINE試劑盒體外轉(zhuǎn)錄而得[16]。將pTol2-CYP3A65-EGFP質(zhì)粒與pCS-TP轉(zhuǎn)座酶mRNA共同注射入斑馬魚胚胎單細(xì)胞，觀察GFP表達(dá)，篩選出在肝和小腸中特異性表達(dá)熒光個(gè)體(F0代)。為了得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，將轉(zhuǎn)基因親代(F0)與野生型斑馬魚雜交，篩選出在肝和小腸有特異性熒光表達(dá)的F1代，通過連續(xù)外交建立Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系。因轉(zhuǎn)基因斑馬魚GFP表達(dá)與CYP3A65基因時(shí)空表達(dá)基本一致[17]，故通過熒光的表達(dá)判斷基因的表達(dá)。

Fig.1 DiagramsofpToI2-CYP3A65-EGFPvector construction.

1.4 暴露實(shí)驗(yàn)及熒光檢測(cè)

熒光顯微鏡下挑選分裂正常的CYP3A65轉(zhuǎn)基因斑馬魚受精卵(F2)，在受精4 h(4 hpf)時(shí)進(jìn)行染毒。采用水浴染毒的方式在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用去離子水溶解成 CuSO40.1，0.2，0.6和0.9 μmol·L－1；CdCl20.35，0.7，1.4，2.7和5.4 μmol·L－1；ZnSO41.5，3，6，12和24 μmol·L－1，DMSO助溶PCB126濃度為2，4，8，16和32 μmol·L－1，濃度均為亞致死劑量，每個(gè)濃度組30枚胚胎。在染毒期間，每隔24 h更換50%染毒液，并及時(shí)挑出死亡個(gè)體。水溫保持在28.5℃，光照/黑暗周期控制在14 h/10 h。實(shí)驗(yàn)暴露時(shí)間分別為96 h和168 h，熒光顯微鏡下觀察斑馬魚幼魚肝和腸道綠色熒光的變化，拍照和記錄。采用Imagepro-Plus6.0圖像分析軟件對(duì)各組進(jìn)行灰度分析，計(jì)算每組幼魚熒光強(qiáng)度的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)比較對(duì)照組與染毒組之間的差異。P＜0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP3A65熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚組織熒光的表現(xiàn)

受精后第 1天(1 dpf)，轉(zhuǎn)基因斑馬魚系〔Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)〕在前腸區(qū)域有微弱熒光表達(dá)(圖2A)；2dpf，Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)在肝胚芽和前腸區(qū)域有弱熒光表達(dá)(圖2B)；3 dpf，Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)在肝處有較強(qiáng)的熒光表達(dá)(圖2C)；4 dpf起，Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)在肝和前腸有強(qiáng)熒光表達(dá)(圖2D和E)。

Fig.2 EGFP expression in Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP) embryos/Iarvae at 1 dpf(A)，2 dpf(B)，3 dpf(C)，4 dpf(D)，5 dpf(E).dpf:day post fertilization.

2.2 銅、鎘、鋅暴露下Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)斑馬魚組織中CYP3A65基因表達(dá)量的變化

2.2.1 銅

Cu2＋對(duì)斑馬魚幼魚CYP3A65基因表達(dá)的影響見圖3。銅染毒96 h后，0.1和0.2 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比有所增強(qiáng)，其中銅0.1 μmol·L－1組為對(duì)照組的約1.5倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；0.6 μmol·L－1組與對(duì)照組比沒有明顯變化；0.9 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱，為對(duì)照組的0.32倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系(圖3A)。染毒168 h后，銅0.1和0.2 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著增強(qiáng)，其中0.1 μmol·L－1組為對(duì)照組的1.79倍，差異顯著(P＜0.01)，相比于染毒96 h熒光表達(dá)誘導(dǎo)作用增強(qiáng)；0.6 μmol·L－1組與對(duì)照組比無明顯變化；0.9 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱(P＜0.01)，為對(duì)照組的0.94倍，相比于染毒96 h對(duì)熒光表達(dá)抑制作用減弱，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出量效關(guān)系(圖3B)。

Fig.3 Effect of copper on enhanced green fIuorescein protein(EGFP)expression of Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP) Iarvae at 96 h(A)and 168 h(B).1:normal control；2－5: exposed to copper 0.1，0.2，0.6 and 0.9 μmol·L－1groups，respectively.C was the semi-quantitative results of A and B.，n＝10.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with control group.

2.2.2 鎘

Cd2＋對(duì)斑馬魚幼魚CYP3A65基因表達(dá)量的影響見圖4。與對(duì)照組比，鎘染毒96 h后，0.35和0.7 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，其中0.35 μmol·L－1組為對(duì)照組的2.8倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，1.4 μmol·L－1組與對(duì)照組比差異無明顯變化，2.7組和5.4 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱，其中5.4 μmol·L－1為對(duì)照組的0.55倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出量效關(guān)系(圖4A)；染毒168 h后，0.35和0.7 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著增強(qiáng)，其中0.35 μmol·L－1組為對(duì)照組的3.4倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，相比于染毒96 h對(duì)熒光表達(dá)誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，1.4 μmol·L－1組與對(duì)照差異仍無明顯變化，2.7組和5.4 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱，其中5.4 μmol·L－1為對(duì)照組的 0.33倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，相比于染毒96 h對(duì)熒光表達(dá)抑制作用增強(qiáng)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖4B)。

2.2.3 鋅

Zn2＋對(duì)斑馬魚幼魚CYP3A65基因表達(dá)量的影響見圖5。與對(duì)照組相比，鋅染毒96 h后，1.5和3 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，其中1.5 μmol·L－1組為對(duì)照阻的2.0倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，6和12 μmol·L－1組與對(duì)照組比差異無明顯變化，24 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱，為對(duì)照組的0.65倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出量效關(guān)系(圖5A)；染毒168 h后，1.5和3 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著增強(qiáng)，其中1.5 μmol·L－1組為對(duì)照阻的2.6倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，相比于染毒96 h對(duì)熒光表達(dá)誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，6 μmol·L－1組與對(duì)照組比差異無明顯變化，12和24 μmol·L－1組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著減弱，其中24 μmol·L－1組為對(duì)照組的0.58倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，相比于染毒96 h對(duì)熒光表達(dá)抑制作用增強(qiáng)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖5B)。

Fig.4 Effect of cadmium on EGFP expression of Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)Iarvae at 96 h(A)and 168 h (B).1:normal control；2－6:exposed to cadmium 0.35，0.7，1.4，2.7 and 5.4 μmol·L－1groups，respectively.C was the semiquantitative results of A and B.n＝10.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with control group.

2.3 PCB126暴露下Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)斑馬魚組織CYP3A65基因表達(dá)量變化

Fig.5 Effectofzinc on EGFP expression of Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)Iarvae at 96 h(A)and 168 h (B).1:normal control；2－6:exposed to zinc 1.5，3，6，12 and 24 μmol·L－1groups，respectively.C was the semi-quantitative results of A and B.n＝10.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with control group.

PCB126對(duì) Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP) CYP3A65基因表達(dá)的影響見圖6。PCB126染毒96 h后，與對(duì)照組比，所有染毒組熒光表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，其中16 μmol·L－1組為對(duì)照組的3.7倍，差異顯著(P＜0.01)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系(圖6A)；染毒168 h后，所有染毒組熒光表達(dá)水平與對(duì)照組比顯著增強(qiáng)，其中16 μmol·L－1組為對(duì)照組的3.8倍，差異顯著(P＜0.01)，相比于染毒(96 h)熒光表達(dá)誘導(dǎo)作用有所增強(qiáng)，隨著染毒濃度的增加，呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系(圖6B)。

Fig.6 Effect of PCB126 on EGFP expression of Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)Iarvae at 96 h(A)and 168 h (B).1:normal control；2－6:exposed to PCB126 2，4，8，16 and 32 μg·L－1groups，respectively.C was the semi-quantitative results of A and B.n＝10.?P＜0.05，??P＜0.01，compared with control group.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)斑馬魚暴露染毒，通過觀察熒光變化，判定對(duì)毒物的生物學(xué)響應(yīng)。本轉(zhuǎn)基因斑馬魚在第4天有較強(qiáng)熒光表達(dá)，受精后4d胚胎孵化已經(jīng)完成，胚胎均已出殼，適合整體觀察，隨著發(fā)育，色素沉積逐漸增多，7 d后大量色素沉積，影響熒光觀察，所以本研究選擇4 d和7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，染毒96 h后，銅、鎘、鋅對(duì)斑馬魚幼魚熒光表達(dá)的總體趨勢(shì)呈現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)而高濃度抑制的作用，染毒168 h后，低濃度組的誘導(dǎo)作用和高濃度組的抑制作用表現(xiàn)得更加明顯。誘導(dǎo)CYP450的作用機(jī)制主要是基因轉(zhuǎn)錄水平的提高[18]，抑制的作用機(jī)制尚不清楚，可能與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的生成及活性有關(guān)。Korashy等[19]研究發(fā)現(xiàn)，重金屬對(duì)CYP450含量的影響與NF-κB和激活蛋白活性密切相關(guān)。Hesham 等[20]證實(shí)重金屬 Cu2＋，汞(Hg2＋)，鉛(Pb2＋)可以直接通過與芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)結(jié)合后誘導(dǎo)CYP1A基因的表達(dá)，毒性與其和AHR的親和力程度有關(guān)，何楨等[21]研究發(fā)現(xiàn)Hg2＋染毒7 d后CYP1A基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)出低濃度升高，中、高濃度降低的變化規(guī)律，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光相對(duì)表達(dá)量的變化規(guī)律基本一致。肖衎等[22]研究發(fā)現(xiàn)Cu2＋，Cd2＋染毒48 h和96 h后，CYP3A mRNA表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用，呈現(xiàn)低濃度暴露誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，高濃度暴露誘導(dǎo)作用減弱的變化規(guī)律，未發(fā)現(xiàn)抑制變化可能與給藥濃度的大小有關(guān)。斑馬魚CYP3A65基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制主要受AHR和孕烷 X受體(pregnane X receptor，PXR)介導(dǎo)[10]，也可通過AHR獨(dú)立介導(dǎo)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3種重金屬可通過與AHR和PXR受體結(jié)合誘導(dǎo)以CYP3A65上游調(diào)控序列指導(dǎo)的GFP基因表達(dá)，為CYP3A65基因mRNA表達(dá)量作為重金屬類污染物的生物指示物提供了一定依據(jù)，其他重金屬暴露能否出現(xiàn)同樣規(guī)律需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量PCB126均對(duì)熒光表達(dá)表現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)作用，且低濃度暴露誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，高濃度暴露誘導(dǎo)作用減弱，呈現(xiàn)顯著的劑量與效應(yīng)關(guān)系；染毒168 h后，誘導(dǎo)作用越明顯。結(jié)果與PCB126對(duì)斑馬魚胚胎CYP1A mRNA表達(dá)影響的變化規(guī)律一致[23]，因其能激活A(yù)HR而誘導(dǎo)CYP1A基因的表達(dá)[1，24]。最新研究發(fā)現(xiàn)，二噁英化合物TCDD或其他AHR激動(dòng)劑可通過AHR2途徑強(qiáng)烈誘導(dǎo)斑馬魚CYP3A65基因的表達(dá)[11，17]。雖然此類化合物對(duì)CYP3A65蛋白及其活性水平變化與CYP3A65轉(zhuǎn)錄水平是否一致還不清楚，但其劑量與響應(yīng)關(guān)系顯著說明了CYP3A65 mRNA水平上的變化可以用于其毒性的檢測(cè)。本轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型用于這3種重金屬和類二噁英化合物等環(huán)境污染物檢測(cè)，可以將環(huán)境污染物進(jìn)行一定梯度的倍比稀釋，觀察各濃度組的熒光表達(dá)變化，通過與對(duì)照組的比較確定是低濃度誘導(dǎo)還是高濃度抑制，從而推算出環(huán)境污染物的濃度范圍。

CYP酶是代謝酶，對(duì)毒物可產(chǎn)生解毒或活化效應(yīng)，本身的表達(dá)改變(誘導(dǎo)或抑制)與毒性的關(guān)系，根據(jù)毒物的性質(zhì)(或種類)的不同而存在差異。本實(shí)驗(yàn)建立的Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)模型對(duì)這3種重金屬的反應(yīng)，從量效關(guān)系分析，銅0.1 μmol·L－1、鎘0.35 μmol·L－1和鋅1.5 μmol·L－1均能使熒光表達(dá)高度上調(diào)；從濃度劑量上觀察銅的誘導(dǎo)作用大于鎘，鎘的誘導(dǎo)能力大于鋅；但如從毒性大小分析，銅的毒性大于鎘，鎘毒性大于鋅。PCB126的熒光表達(dá)隨濃度增高而增加，16 μmol·L－1時(shí)達(dá)到最大值，在相同劑量下熒光誘導(dǎo)強(qiáng)度比這3種重金屬偏弱，表明毒性比它們的毒性低。其他生物學(xué)效應(yīng)需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重金屬(銅、鎘、鋅)和類二噁英化合物(PCB126)對(duì)CYP3A65熒光標(biāo)記斑馬魚幼魚熒光強(qiáng)度有一定的影響，具有一定的量效關(guān)系，表明斑馬魚CYP3A65基因調(diào)控序列(－6.3 kb)調(diào)控GFP建立的熒光標(biāo)記斑馬魚Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)模型，在一定的濃度范圍內(nèi)能夠檢測(cè)銅、鎘、鋅及二噁英等環(huán)境污染物。

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Generation of cytochrome P-450 CYP3A65 IabeIed fIuorescence transgenic zebrafish and its bioIogicaI response to environmentaI poIIutants

LI Chun-jie1，2，ZHAO Jian2，ZHANG Shi-yong3，PAN Wei-tong2，PU Yun-zhu2，JIA Qi-yan2，ZHA Xiao-dan2，SHANG Yan-nan2，HUANG Chun-qian2，LIU Yan-qin2，ZHONG Yu-xu2，LI Qian2，DING Ri-gao2，F(xiàn)U Ai-ling1，ZHAO Bao-quan2
(1.School of Pharmaceutical Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Counter，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.Department of Osteology，the First People′s Hospital of Kerchin District，Tongliao 028000，China)

OBJECTIVE To establish Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)transgenic zebrafish for quick，intuitive detection of heavy metals(copper，cadmium and zinc)，dioxin-like PCBs(PCB126)and other environmental pollutants.METHODS Tol2 transposon system was used to generate transgenic zebrafish lines Tg(－6.3CYP3A65∶EGFP)in which CYP3A65 promoter regualated labeled fluorescence. The effect of heavy mentals(copper，cadmium and zinc)and PCB126 on the relative amounts of CYP3A65 gene expression was determined by observing the change in fluorescence intensity.RESULTS The relative gene expression of CYP3A65 was significantly increased after 96 h exposure to copper 0.1 and 0.2 μmol·L－1，cadmium 0.35 and 0.7 μmol·L－1，zinc 1.5 and 3 μmol·L－1，and PCB126 2－32 μmol·L－1，respectively(P＜0.01)，but decreased after 96 h exposure to copper 0.9 μmol·L－1，cadmium 2.7 and 5.4 μmol·L－1，and zinc 24 μmol·L－1，respectively(P＜0.01).CYP3A65 gene expression was significantly increased after 168 h exposure to copper 0.1 and 0.2 μmol·L－1，cadmium 0.35 and 0.7 μmol·L－1，zinc 1.5 and 3 μmol·L－1，and PCB126 2－32 μmol·L－1，respectively(P＜0.01)，but decreased after 168 h exposure to copper 0.9 μmol·L－1，cadmium 2.7 and 5.4 μmol·L－1，and zinc 12 and 24 μmol·L－1(P＜0.05)，in a concentration-dependent manner.CONCLUSION The results suggest that zebrafish CYP3A65 gene expression and the CYP3A65 labeled fluorescence lines can be another candidate biomarker for detecting environmental pollutants.

cytochrome P-450 CYP3A65；zebrafish，transgenic；copper；cadmium；zinc；polychlorinated biphenyls

ZHAO Bao-quan，E-mail:baoquan9838＠sina.com，Tel:(010)66874609

R965

:A

:1000-3002(2014)06-0870-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.009

Foundation item:The project supported by Major Projects of the PLA Medical Science and Technology″Twelfth Five-Year plan″(BWS11R021)；and National Science and Technology Major Project of China(2013ZX09402103)

2014-02-28 接受日期:2014-09-30)

(本文編輯:喬 虹)

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目重點(diǎn)課題(BWS11R021)；國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX09402103)

李春杰，男，碩士研究生，主要從事分子毒理學(xué)研究，E-mail:jeyclee＠126.com；趙寶全，男，博士，副研究員，主要從事生化與分子藥理學(xué)研究。

趙寶全，E-mail:baoquan9838＠sina.com，Tel:(010)66874609