人LL-37與干擾素α2a密碼子的優(yōu)化及其在畢赤酵母中的融合表達

張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

人LL-37與干擾素α2a密碼子的優(yōu)化及其在畢赤酵母中的融合表達

張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

通過密碼子優(yōu)化，在畢赤酵母中高效表達人LL-37與IFN-α2a融合蛋白。先按P. pastoris密碼子偏好性對LL-37與IFN-α2a的原始密碼子進行了改造，并在二者之間加上GlyGlyGlyGlySer的柔性連接接頭，人工合成設計的新序列，最后通過pPIC9K載體將其整合入P. pastoris GS115的基因組，構建出重組菌株GS115LI。利用遺傳霉素濃度梯度篩選出兩株高拷貝的GS115LI1和GS115LI2菌株。對這兩株菌經(jīng)發(fā)酵誘導后的發(fā)酵液進行SDS-PAGE檢測、抗病毒活性檢測和抗菌活性檢測，證明重組株既能夠成功表達出LL-37與IFN-α2a的融合蛋白，而且該融合蛋白成功保留了抗菌肽與干擾素的功能活性。誘導發(fā)酵后，融合蛋白的產(chǎn)量可達到819.1 mg/L，經(jīng)鹽析、疏水層析和離子交換層析分離，可得到純度達97%的融合蛋白產(chǎn)物，回收率可達到46.2%，純化后產(chǎn)品的效價可達2.6×108IU/mg。經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，成功實現(xiàn)在畢赤酵母中高效表達出既有LL-37抗菌活性又具有干擾素α2a活性的融合蛋白。

干擾素α2a LL-37 融合 表達

干擾素發(fā)現(xiàn)于1957年，后續(xù)的研究證實其具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等生理功能，可由人或動物的機體在受到病毒的侵擾下誘導產(chǎn)生，同時某些細菌和化合物也能刺激機體的細胞合成干擾素［1］。

按合成干擾素的細胞差異，通常將干擾素區(qū)分為α、β、γ三型，其中α主要由白細胞合成，β型主要由成纖維細胞合成，γ型主要由T細胞合成。每一型又根據(jù)氨基酸組成上的差異進一步分為亞型，α的

亞型最多，目前有23個［2］。根據(jù)干擾素作用方式的不同，又可將干擾素分為I、II和III型，α型與β型屬于I型，均與一個獨特的細胞表面受體結合發(fā)揮抗病毒與腫瘤作用；γ為II型，主要起調節(jié)免疫作用；新發(fā)現(xiàn)的λ干擾素擁有與I型不同的結合受體，歸為III型［3，4］。α干擾素穩(wěn)定性非常高，能在2.0-10.0的pH范圍內維持結構穩(wěn)定，在56℃條件下維持30 min活性不降低，抗病毒和腫瘤的譜系寬廣，是目前臨床上最普遍使用的抗病毒和抗腫瘤藥物［5，6］。

目前，干擾素均通過基因工程技術生產(chǎn)。α干擾素在生產(chǎn)和使用過程中存在的主要問題一是基因工程菌產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；二是α干擾素分子量小，容易被腎小球濾過，臨床應用時半衰期短，約每2 d就需要重新用藥一次［7，8］。對于產(chǎn)量低的問題，目前主要通過優(yōu)化表達系統(tǒng)和發(fā)酵工藝方面著力。對于半衰期短的問題，目前常采取的方法包括PEG修飾以增加分子量，掩蓋分子表面的抗原決定簇和蛋白酶作用位點［9，10］；同人白蛋白或免疫球蛋白Fc片段融合增加分子量，減少腎小球濾過［11，12］；在合適的位置引入糖基化掩蔽蛋白酶位點和增大分子量［13］等。很多病毒均具有誘發(fā)腫瘤的能力，因此同時具有抗病毒與抗腫瘤能力的α干擾素在此類疾病的治療方面作用重要。同時，多數(shù)腫瘤患者由于其自身的免疫系統(tǒng)不同程度的受到破壞，因此，還需特別預防細菌感染。基于臨床需要同時抗真菌、抗細菌和抗腫瘤的特點，將人IFN-α2a與LL-37經(jīng)過按畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化，構建高產(chǎn)工程菌，以期在此基礎上生產(chǎn)出長效的三聯(lián)干擾素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α與畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115由本試驗保藏。

1.1.2 載體 pPIC9K由本試驗保藏；pMD18-T由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；MD、MM、YPD固體培養(yǎng)基；BMGY與BMMY液體培養(yǎng)基參考文獻［4］。

1.1.4 主要試劑 PCR聚合酶（TaKaRa La Taq）、限制性內切酶、T4連接酶、質粒少量提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒等均購自寶生物工程（大連）有限公司。其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 人LL-37與IFN-α2a DNA序列的密碼子優(yōu)化 在保證人LL-37與IFN-α2a氨基酸序列完整性的前提下，按照P. pastoris對密碼子的偏好性特點，對他們的DNA序列進行優(yōu)化［5］。

1.2.2 融合表達結構設計 選用pPIC9K質粒為表達載體，表達結構如圖1所示。

圖1 人LL-37與IFN-α2a表達的DNA序列結構設計

1.2.3 基因合成 經(jīng)過密碼子優(yōu)化和結構設計所得的序列，再在5'端和3'端分別加上EcoR I和Not I雙酶切位點，交由上海生物工程公司全序列合成，克隆至pMD18-T載體，構建質粒pMD-18 Fall-IFN。

1.2.4 重組質粒構建 分別用EcoR I和Not I雙酶切pPIC9K和pMD-18 Fall-IFN質粒，經(jīng)凝膠電泳后切膠分別回收約9 300 bp和700 bp的片段，用膠回收試劑盒回收片段，并用T4 ligase連接，構建分泌型重組質粒pPIC9K-Fall-IFN，用CaCl法轉化大腸桿菌DH5α［6］，利用LB-Amp平板篩選重組子。挑選陽性轉化子送上海生工進行測序，確定質粒的結構。

1.2.5 重組質粒轉化畢赤酵母 用Sac I單酶切pPIC9K-Fall-IFN成線性重組質粒，通過電擊轉化法將其轉入P. pastoris GS115中構建重組菌P. pastoris GS-115LI。電擊條件為1 500 kV，200 Ω，25 μF。轉化液涂布于MD平板30℃靜止培養(yǎng)3 d，挑選陽性克隆，搖瓶后，用真菌基因組提取試劑盒提取基因組進行PCR鑒定。引物為：SenseP1：5'-TTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTC-3'，AntisP2：5'-TCACTCCTTAGATCTCAAAGACTC-3'，退火溫度為58℃，以GS115基因組及未加模板的體系為對照組。

1.2.6 重組菌表型鑒定及多拷貝篩選 通過甲醇利用情況進行重組菌表型鑒定。將PCR鑒定的陽性轉化子編號，并將每菌株用滅菌牙簽同時接種MD和MM平板，30℃靜止培養(yǎng)5 d，觀察各菌株在兩種平板上的生長情況。

通過遺傳霉素（G418）濃度梯度篩選多拷貝重

組株。首先制備遺傳霉素質量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0和3.0 mg/mL的YPD平板，然后將前面篩選的表型正常的重組菌株用滅菌牙簽點在5個遺傳霉素梯度平板上，30℃靜止培養(yǎng)4 d，觀察結果，能在高濃度下生長良好的菌株為多拷貝菌株。

1.2.7 融合蛋白發(fā)酵與純化 將篩選的重組菌株，接種于25 mL BMGY培養(yǎng)液中，30℃ 250 r/min培養(yǎng)約16 h，至菌液OD600≈5，4℃ 4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用25 mL BMMY培養(yǎng)液重懸細胞，誘導培養(yǎng)，每24 h按體積比為0.5%加入純甲醇，連續(xù)誘導144 h以上，4℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清于-20℃凍存待用。

上清液中融合蛋白先用35%飽和度（NH4）2SO4鹽析，12 000 r/min離心收集鹽析沉淀，再將沉淀溶于0.8 mol/L（NH4）2SO4（pH8.3），上樣Phenyl-Sepharose FF疏水柱，用0.5 mol/L（NH4）2SO4洗脫后透析除鹽，樣品濃縮后再上樣DEAE Sephadex A-25陰離子交換柱，采用0.3 mol/L NaCl洗脫，收集含目的蛋白洗脫峰，濃縮后采用Sephacyal-HR200分子篩脫鹽，冷凍干燥得最終產(chǎn)品。

1.2.8 融合蛋白純度檢測 用SDS-PAGE法檢測融合蛋白純度，檢測參照文獻［8］進行。以TaKaRa蛋白分子質量標準（低）為Marker。以未經(jīng)誘導的發(fā)酵液為空白對照。

1.2.9 融合蛋白濃度檢測 以牛血清白蛋白為標準，按Lowry法測定融合蛋白濃度。

1.2.10 融合蛋白產(chǎn)物活性分析 培養(yǎng)液中IFN-α2a的活性分析參照《中國藥典2010版》中《干擾素效價測定（細胞病變抑制法）》?；钚詷藴势焚徸詮V州市藥品檢測所。以總IFN-α2a活性計算純化過程中的回收率。

培養(yǎng)液中LL-37的活性測定參照文獻［17］。用大腸桿菌ATCC 25922以及ML 35p作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養(yǎng)基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10 μL發(fā)酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，37℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h，測量無菌生長的透明環(huán)直徑?？咕钚砸韵率接嬎悖嚎咕钚詥挝唬║）=（抗菌環(huán)直徑-3）×10。

2 結果

2.1 LL-37與IFN-α2a DNA序列的密碼子優(yōu)化

人LL-37 DNA序列按P. pastoris密碼子偏好性優(yōu)化的結果見表1。

表1 LL-37密碼子優(yōu)化結果

經(jīng)修改后，人LL-37 DNA全序列經(jīng)Primer premier 5.0按標準密碼表翻譯后所得蛋白序列，與原始序列經(jīng)同樣方法翻譯后的蛋白序列，用www.nlm. ncbi.nih.gov 的Protein Blast比對完全一致，表明對人LL-37 DNA全序列按畢赤酵母的密碼子偏好性改變后，不影響其產(chǎn)物的結構組成。同時，序列G+C含量由優(yōu)化前的49%提高至優(yōu)化后的53%。G+C含量的升高將對基因轉錄和翻譯的速度提高有利。

人IFN-α2a DNA序列按P. pastoris密碼子偏好性優(yōu)化的結果見表2。

表2 人IFN-α2a DNA密碼子優(yōu)化結果

經(jīng)修改后的DNA序列同前LL-37一樣進行分析，表明修改后蛋白結構未發(fā)生改變，但其中G+C含量由48.85%下降至47.26%，比原始含量降低了1.59%。該G+C含量的變動在可接受的范圍，不會對后續(xù)的轉錄和翻譯速度產(chǎn)生明顯的影響。

2.2 人LL-37與IFN-α2a融合重組質粒的構建

經(jīng)過優(yōu)化的人LL-37 DNA序列（3'端不帶終止密碼子），通過4個甘氨酸和1個絲氨酸與IFN-α2a柔性聯(lián)結。重組質粒pPIC9K-Fall-IFN的構建過程見圖2。

將構建的質粒pPIC9K-Fall-IFN轉化入感受態(tài)E. coli DH5α，所挑選的陽性轉化子經(jīng)搖瓶提取質粒，用EcoR I和Not I雙酶切鑒定得到大小約為9 300 bp和690 bp的兩條片段，與預期的結構一致。同時將質粒送樣測序，得到的DNA序列與設計的結果一致。

圖2 重組質粒pPIC9K-Fall-IFN構建過程

2.3 重組質料pPIC9K-Fall-IFN整合入畢赤酵母GSP115

重組菌P. pastoris GS115LI與原始菌P. pastoris GS115基因PCR結果（圖3）顯示，重組酵母基因組可擴增得到大小約為690 bp的條帶，而空白的原始菌株GS115卻在相應位置未出現(xiàn)相應的條帶，這表明重組質粒pPIC9K-Fall-IFN成功整合進入了酵母的基因組中，所獲得的重組菌P. pastoris GS115LI與預期結果一致。

圖3 重組P. pastoris GS115LI與原始菌P. pastoris GS115基因PCR結果

2.4 篩選Mut+及多拷貝編碼基因重組菌

P. pastoris GS115為組氨酸缺陷型（His-），因此不能在不含組氨酸的MD平板上生長。整合了含組氨酸編碼基因（His4）質粒pPIC9K-Fall-IFN的菌株P. pastoris GS115LI，由于獲得了組氨酸的合成能力，因此可以在不含組氨酸的MD平板上正常生長，以此證明重組菌株P. pastoris GS115LI可以正確地表達質粒pPIC9K-Fall-IFN的轉錄單元。結果表明，前述試驗所篩選出來的陽性克隆pPIC9K-Fall-IFN均可以在MD平板上正常生長，表明其都具有正確的表型（Mut+）。

通常情況下，重組菌株中質粒pPIC9K-Fall-IFN的拷貝數(shù)越高，其表達目的產(chǎn)物的能力就越強，同時對遺傳霉素G418的抗性就越強。因此，通過遺傳霉素濃度梯度篩選出在高濃度下生長的菌株，即表明其具有較高的拷貝數(shù)。本試驗得到了在遺傳霉素為3 mg/mL濃度下能正常生長的重組菌二株，分別命名為GS115LI1和GS115LI2，以供后續(xù)試驗。

圖4 經(jīng)過誘導和未誘導的GS115LI1發(fā)酵液的SDS-PAGE

2.5 表達產(chǎn)物Fall-IFN-α2a分子檢測

經(jīng)過誘導和未經(jīng)誘導的GS115LI1發(fā)酵液的SDS-PAGE分析（圖4）顯示，在蛋白Marker的

表3 LL-37與IFN-α2a融合蛋白抗病毒與抗菌活性檢測

2.7 融合蛋白純化結果

融合蛋白的純化結果（表4）顯示，在LL-37與IFN-α2a融合蛋白純化過程中，總的回收率為46.2%，其中疏水層析的損失最大，達到20.2%，其次為鹽析損失19.0%，陰離子交換層析損失14.6%。最終產(chǎn)品的純度達到97%，滿足了醫(yī)用產(chǎn)品的質量標準。利用Lowry法檢測分子篩脫鹽后的溶液融合蛋白總量（相當于牛血清白蛋白）為378.4 mg，換算成產(chǎn)品的IFN-α2a活性為2.6×108IU/mg，發(fā)酵液中產(chǎn)物的產(chǎn)量為819.1 mg/L。

表4 LL-37與IFN-α2a融合蛋白純化過程中的純度與回收率

3 討論

LL-37是由人上皮細胞產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的37肽，具有廣譜抗菌特性［18］。IFN是臨床常用的抗病毒藥物，已經(jīng)有將其與多種蛋白融合表達以改進性能或增加功能的研究報道。例如，將其與載脂蛋白融合表達，可以增加干擾素在特定組織中的滲透性［19］；與人白蛋白融合表達以延長干擾素的體內半衰期［20］；與特異抗體表達以制備成靶向干擾素等［21］。到目前為止，未見有將干擾素與抗菌肽融合表達的報道。將干擾素與具有抗病毒和抗腫瘤活性的IFN-α2a融合表達，形成同時兼具抗菌、抗病毒和抗腫瘤的三重功效，特別適用于一些腫瘤患者的臨床應用。LL-37與IFN-α2a的原始DNA序列的密碼子組成是與人的表達系統(tǒng)相適應的，二者在P. pastoris中表達時，容易出現(xiàn)密碼子偏好性不同而降低產(chǎn)物的表達翻譯速度，難以獲得高產(chǎn)。在本試驗中，首先按P. pastoris密碼子偏好性對LL-37與IFN-α2a的原始密碼子進行了改造，并在二者之間加上GlyGlyGlyGlySer的柔性連接接頭，然后將設計的新序列通過人工合成，最后通過pPIC9K載體將其整合入P. pastoris GS115的基因組，構建出重組菌株GS115LI。經(jīng)過設計特異性引物進行PCR檢測，可以在GS115LI基因組中克隆出700 bp左右的DNA片段，表明融合的基因成功整合入宿主的基因組。利用遺傳霉素濃度梯度篩選出兩株高拷貝的GS115LI1和GS115LI2。對這兩株菌經(jīng)發(fā)酵誘導后的發(fā)酵液進行SDS-PAGE檢測、抗病毒活性檢測和抗菌活性檢測，證明重組株既能夠成功表達出LL-37與IFN-α2a的融合蛋白，而且該融合蛋白成功保留了抗菌肽與干擾素的功能活性。

融合蛋白中的LL-37帶有部分負電荷，與同樣帶部分負電荷的IFN-α2a融合后，可以采用陰離子交換層析對其進行純化。產(chǎn)物經(jīng)過鹽析、疏水層析和陰離子交換三步純化后，純度可達97%，能滿足藥典的純度要求。該工藝的缺點是回收率只有46.2%，這是非親和層板純化干擾素類產(chǎn)品的普遍通?。?2］。采用帶親和標簽的方式進行表達，利用親和層析方式純化，可以克服收率低的問題，但又會產(chǎn)生成本高的缺陷［23］。低成本高回收率的干擾素類產(chǎn)品純化工藝還需要進一步研究。20.1-29 kD之間，如圖中箭頭所示，誘導菌株具有明顯的條帶，未誘導菌株在相應位置無條帶。LL-37與IFN-α2a融合蛋白的分子量約為26 kD，與圖中預期的一致。因此，可以判斷GS115LI1成功表達出了所需的LL-37與IFN-α2a融合蛋白。

2.6 重組菌株GS115LI產(chǎn)物活性分析

融合蛋白的抗病毒活性與抗菌活性測定結果（表3）顯示，重組菌GS115LI1與GS115LI2經(jīng)誘導后的發(fā)酵液中均能檢出較高的抗病毒和抗菌活性，這說明了融合蛋白保證了二者各自的活性功能。

表達LL-37與IFN-α2a融合蛋白的工程菌的發(fā)酵工藝也是影響產(chǎn)品產(chǎn)量的重要因素［24］。本試驗采用通用的方法對工程菌進行了誘導表達，獲得了819.1 mg/L的產(chǎn)量，但還需要通過單因素試驗和統(tǒng)計學試驗方法對各工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

表達出來的LL-37與IFN-α2a融合蛋白，同時兼具抗菌、抗病毒和抗腫瘤的三重活性，特別適用于一些危重的腫瘤患者，因此該產(chǎn)品具有廣泛的市場前景。

4 結論

通過密碼子優(yōu)化，構建出了在畢赤酵母人L-37與IFN-α2a融合蛋白重組菌株。經(jīng)對重組菌發(fā)酵誘導后的發(fā)酵液進行SDS-PAGE檢測、抗病毒活性檢測和抗菌活性檢測，證明重組株既能夠成功表達出LL-37與IFN-α2a的融合蛋白，而且該融合蛋白成功保留了抗菌肽與干擾素的功能活性。誘導發(fā)酵后，融合蛋白的產(chǎn)量可達到819.1 mg/L，經(jīng)鹽析、疏水層析和離子交換層析分離，可得到純度達97%的融合蛋白產(chǎn)物，回收率可達到46.2%，純化后產(chǎn)品的效價可達2.6×108IU/mg。

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（責任編輯 馬鑫）

The Codon Optimization and Fused Expression of LL-37 and IFN-α2a in Pichia pastoris GS115

Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）

To express the fussed protein of human LL-37 and IFN-α2a in Pichia pastoris with codon optimization. Recording to the codon preference of P. pastoris, the codons of LL-37 and IFN-α2a were optimized. A flexible linker of GlyGlyGlyGlySer was placed between LL-37 and IFN-α2a. The newly scheming DNA sequence was synthesized chemically. P. pastoris GS115LI was constructed by integrating the new gene into GS115 with help of plasmid pPIC9K. With the scanning of geneticin concentration ladder, two strains, named as GS115LI1 and GS115LI2, were gotten with high copy number. With SDS-PAGE detection, anti-virus activity detection and antimicrobial activity detection of broth, the results proved GS115LI1 and GS115LI2 not only expressed the fused proteins, but also maintained the activities of LL-37 and IFN-α2a respectively. After fermentation and induction of recombinant, the productivity of fusion protein was 819.1 mg/L. With salting out, hydrophobic chromatography and ionic exchange chromatography, the purity of fusion protein was 97%, recovery rate was 46.2% and the potency of IFN was 2.6×108IU/mg. After codon optimization, the fused protein of human LL-37 and IFN-α2a was expressed effectively in P. pastroris with antimicrobial activity of LL-37 and antifungus activity of IFN-α2a.

IFN-α2a LL-37 Fused protein Expression

2014-03-31

廣東省重大科技專項（2011A080502011）

張明杰，教授，研究方向：微生物工程技術；E-mail：mingjiezh@126.com