植物多肽信號分子CLE家族

高麗

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050026）

植物多肽信號分子CLE家族

高麗

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050026）

動物中存在眾多多肽信號分子，它們在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。近幾年，對植物中多肽信號分子的研究取得了重大突破，它們積極參與調(diào)控植物生長發(fā)育的眾多過程，同時也表明多肽信號分子在細胞之間的“交流”過程中發(fā)揮作用在進化上是保守的。CLE（CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION）家族是目前植物領(lǐng)域研究較熱的多肽信號分子家族，通過對擬南芥CLV3和百日草TDIF等CLE多肽信號分子的研究發(fā)現(xiàn)，CLE蛋白在成為有功能活性的信號分子之前，存在翻譯后蛋白剪切和修飾的過程，這方面與動物中多肽信使的成熟過程相似。對CLE家族成員的分子特征、生物學(xué)功能、翻譯后的加工修飾和研究中出現(xiàn)的問題進行綜述，并對本領(lǐng)域未來的發(fā)展方向作出展望。

多肽信號分子 CLE多肽家族 受體激酶 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 擬南芥

對于多細胞生物而言，細胞與細胞之間需要通過“交流”來調(diào)節(jié)其生長、增殖和分裂等發(fā)育過程。自1922年發(fā)現(xiàn)第一個動物細胞外多肽信使——胰島素以來［1］，眾多具有功能活性的胞外多肽信號分子被發(fā)現(xiàn)，其對于動物體內(nèi)細胞間的交流發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用［2］。它們在結(jié)構(gòu)上具有一個明顯的特征，即來自于一個分子量較大的蛋白前體，在經(jīng)歷去除信號肽和蛋白酶的剪切后，成為有功能活性的多肽信使［3］。

相較于動物，植物多肽信號分子的研究就顯得較為滯后，雖然植物細胞間的通訊主要依賴植物激素（植物生長素、細胞分裂素、脫落酸和油菜素類固醇等），但是多肽信號分子已成為植物細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中的重要介質(zhì)［4］。1991年發(fā)現(xiàn)植物界第一個多肽信使——系統(tǒng)素，番茄中成熟的系統(tǒng)素含有18個氨基酸，來自由200個氨基酸構(gòu)成的蛋白前體。系統(tǒng)素誘導(dǎo)受傷葉片產(chǎn)生蛋白酶抑制劑，昆蟲攝食后，將影響其消化系統(tǒng)的功能，從而阻止昆蟲對植物的繼續(xù)侵害［5］。從蘆筍懸浮培養(yǎng)細胞中純化得到一個經(jīng)過磺酸化修飾的五肽-植物磺肽素

（Phytosulfokine，PSK），具有調(diào)節(jié)細胞的去分化和再分化的功能［6］。POLARIS（PLS）多肽分子由36個氨基酸構(gòu)成，參與調(diào)控擬南芥根和葉脈管的發(fā)育過程［7］。Inflorescence Deficient in Abscission（IDA）多肽分子由77個氨基酸構(gòu)成，參與調(diào)控擬南芥花器官的脫落［8］。ROUTUNDIFOLIA4（ROT4）多肽分子由53個氨基酸構(gòu)成，其在葉子形態(tài)建成中調(diào)控極性依賴的細胞增殖過程［9］。

CLE基因編碼一個迄今為止在植物中最龐大的多肽分子家族［10］，其名稱源自最早發(fā)現(xiàn)的兩個成員：擬南芥中的CLAVATA3（CLV3）［11］和玉米中的胚胎周邊區(qū)（Embryo surrounding region，ESR）［12］。擬南芥基因組中含有32個CLE基因［13］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CLE多肽信號分子在植物生長發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要作用。本研究就CLE家族成員的分子結(jié)構(gòu)特征、參與調(diào)控的發(fā)育過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（包括多肽信使的受體和信號途徑下游組分）進行綜述，并對未來的研究趨勢作出展望。

1 CLE基因家族成員的分子特征

CLE家族成員在分子結(jié)構(gòu)上具有若干共同特點［14］：（1）均編碼分子量小于15 kD的多肽；（2）CLE的氨基端（N端）均含有一段疏水的氨基酸序列，該序列能夠引導(dǎo)CLE多肽進入分泌途徑；（3）成員間的DNA序列或蛋白質(zhì)序列有較大差異，但是其都含有一段靠近羧基端（C端）的由14個氨基酸構(gòu)成的保守序列——CLE基序（CLE motif）（表1）。利用飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）在超表達CLV3的愈傷組織中發(fā)現(xiàn)有活性的CLV3多肽分子，該多肽僅由CLE motif中的12個氨基酸構(gòu)成（CLE基序N端和C端各去除一個氨基酸），即十二肽基序［15］。

擬南芥32個CLE基因分散于基因組的各個部位，在5條染色體上均有分布。CLE基因拷貝在擬南芥中有驚人的豐富度，猜測是在進化過程中基因組的至少3次復(fù)制所致［16］。利用RT-PCR分析擬南芥CLE基因的表達模式，大多數(shù)成員具有較大的表達范圍，但也有少數(shù)成員的表達范圍局限在特定的組織或器官中，并且大多數(shù)組織中均能檢測到多個CLE基因的表達［17］。同源性相近的CLE基因不一定具有相同的表達模式，如旁系同源基因CLE3和CLE4的表達區(qū)域并不完全重合，暗示它們雖然是基因復(fù)制的產(chǎn)物，但卻進化出在不同的組織行使相類似或者不同的功能；而另一對旁系同源基因CLE5和CLE6的表達區(qū)域重合，暗示它們在功能上可能具有冗余性，共同調(diào)控某一發(fā)育過程［10，18-20］。

表1 CLE多肽分子家族

2 CLE基因的生物學(xué)功能

2.1 CLV3調(diào)控擬南芥莖頂端分生區(qū)發(fā)育

植物莖頂端分生區(qū)（Shoot apical meristem，

SAM）中心區(qū)的干細胞將進入到旁側(cè)外圍區(qū)和肋側(cè)區(qū)，發(fā)育成為新的器官和組織，所以對于SAM中干細胞增殖和分化的調(diào)控，將直接決定植物地上部分的生長發(fā)育［21］。受體激酶CLV1的胞外域具有21個亮氨酸重復(fù)序列，胞內(nèi)為絲氨酸/蘇氨酸激酶域。受體樣蛋白CLV2的胞外域與CLV1的結(jié)構(gòu)類似，但其胞內(nèi)域極短無激酶域。CLV3編碼由干細胞分泌到細胞外的多肽信使，含有96個氨基酸。CLV1在SAM中心區(qū)域的第2層和第3層細胞中表達，CLV2在所有組織中均有表達，CLV3在中心區(qū)域的第1層和第2層細胞中表達。clv突變體中SAM異常膨大，花器官數(shù)目增加，表明CLV具有抑制SAM中干細胞增殖，并促進其分化的功能［11］。

決定SAM中干細胞發(fā)育的另一重要基因是WUSCHEL（WUS），編碼由291個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子。WUS在SAM的組織中心（SAM organizing center，OC），即中心區(qū)域第3層細胞下的區(qū)域中表達。wus突變體器官數(shù)量明顯減少，并提前進入終分化階段；WUS異位表達將誘導(dǎo)干細胞的形成，表明WUS具有決定干細胞表達的位置和維持其數(shù)量的作用［22］。利用動態(tài)共聚焦顯微鏡來捕獲基因定量變化，去除CLV3信號后WUS表達從OC向外圍擴展［23］，超表達CLV3會產(chǎn)生類似于wus突變體的表型［24］。表明WUS在OC區(qū)表達后，運動到其上方CLV3表達的區(qū)域，結(jié)合CLV3啟動子并誘導(dǎo)CLV3表達；而CLV3則抑制WUS基因的表達，從而形成CLV3-WUS反饋環(huán)路來調(diào)控SAM干細胞增殖與分化間的平衡［25］（圖1-A）。

2006 年發(fā)現(xiàn)CLV1的同源基因BAM1、BAM2和BAM3，均編碼胞外域富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶，蛋白質(zhì)序列與CLV1具有高度的相似性。雙突bam1 bam2的SAM減少至野生型的一半，三突bam1 bam2 bam3的SAM提前分化終止并且花器官數(shù)目減少，說明BAM和CLV1基因?qū)τ谇o和花分生區(qū)中干細胞的調(diào)控作用相反［26］。利用免疫共沉淀技術(shù)，檢測到CLV1/CLV1和CLV1/BAM1能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合體。利用同位素標(biāo)記的CLV3-CLE-motif檢測到與之結(jié)合的CLV1、BAM1和BAM2，說明受體復(fù)合體CLV1/CLV1和CLV1/BAM參與CLV3信號傳遞［27］。2008年篩選得到基因CORYNE（CRN）的突變體，其SAM因干細胞大量增殖而變大。CRN編碼一個胞外域很短的受體樣蛋白激酶，在SAM的第1、2、3層細胞中有大量表達［28］。遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析表明，CRN與CLV2相互作用與CLV1形成兩條平行獨立的通路來應(yīng)答CLV3信號［29］。2010年篩選得到基因Receptor-like Protein Kinase2（RPK2）的突變體rpk2，其表型類似于CLV突變所產(chǎn)生的莖頂端膨大和多心皮的表型。RPK2編碼一個受體激酶，其在莖、花和根的分生區(qū)及維管束中均有表達。雙突wus rpk2呈現(xiàn)出類似于wus的表型，在rpk2突變體中超表達WUS，造成SAM增大，表明WUS基因位于RPK2基因的上位，RPK2是CLV3-WUS反饋調(diào)控環(huán)路中的一個成員。免疫共沉淀檢測到RPK2不能與CLV1、CLV2或CRN相互作用，但卻能夠形成同源二聚體RPK2/RPK2［30］，說明RPK2可能以二聚體的形式參與CLV3信號的傳遞，從而對SAM干細胞的維持起作用。

目前發(fā)現(xiàn)的CLV3-WUS反饋調(diào)控環(huán)路中的信號組分有4種：（1）Kinase-associated protein phosphatase（KAPP）直接與CLV1胞內(nèi)激酶域相互作用，作為負調(diào)控因子來調(diào)控CLV3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［31］；（2）POLTERGEIST（POL）和POL-LIKE（PLL1）均為CLV下游的信號組分，具有維持并促進WUS在SAM表達的作用［32，33］；（3）Rho GTPase-related protein（ROP）與CLV1共處于一個蛋白復(fù)合體中，可能參與促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）級聯(lián)途徑［34］；（4）MAPKs參與CLV3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，CLV3信號將引發(fā)磷酸接力傳遞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［35］，暗示這種磷酸接力傳遞機制可能普遍存在于CLE的信號傳遞過程；（5）體外試驗表明，由153個氨基酸構(gòu)成的CCI1與CLV1胞內(nèi)激酶域相互作用［36］，并且WUS調(diào)控CCI1的轉(zhuǎn)錄［37］，暗示CCI1可能參與CLV3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.2 FON4/FON2調(diào)控水稻莖頂端分生區(qū)發(fā)育

通過研究水稻中FON4/FON2的功能，揭示出在其他植物物種中也存在類似于CLV3多肽信使調(diào)控SAM發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。FON4/FON2與CLV3具有相似的基因結(jié)構(gòu)，并且含有高度保守的CLE motif。fon4/fon2突變體的SAM異常膨大，并且花器

官數(shù)目明顯多于野生型。對FON4/FON2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行組織定位分析，結(jié)果類似于CLV3的表達模式，即僅在莖和花頂端的一小群細胞中轉(zhuǎn)錄。遺傳學(xué)分析表明，F(xiàn)ON4/FON2能夠恢復(fù)clv3突變體的表型，并且在擬南芥野生型中超表達FON4/FON2，能夠模擬出CLV3超表達產(chǎn)生的表型［13］。

圖1 CLE參與植物發(fā)育的分子調(diào)控示意圖

FON1編碼一個類似于CLV1的質(zhì)膜受體樣蛋白激酶，其在水稻花分生區(qū)干細胞增殖和分化過程中發(fā)揮作用［38］。FON4/FON2和FON1在遺傳上相互作用，表明FON4/FON2-FON1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑類似于擬南芥CLV3-CLV1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［13］。fon4/fon2突變體表型強于fon1突變體表型，說明FON4/FON2的受體不僅僅只有FON1。受體樣蛋白激酶OsLRK1與FON1具有高度的同源性，利用RAN干擾技術(shù)，干擾OsLRK1基因正常表達，植株表現(xiàn)出SAM增大和花器官明顯增多的表型［39］，暗示OsLRK1是FON4/FON2的受體，與FON1共同參與調(diào)控水稻SAM中干細胞的發(fā)育。雖然擬南芥和水稻兩個物種的關(guān)系較遠，但存在相似的調(diào)控莖和花分生區(qū)干細胞增殖與分化的機制，推測在較大范圍的開花植物中存在類似于CLV3多肽信使調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.3 CLE19/CLE40調(diào)控擬南芥根（向重力性和根尖分生區(qū)）發(fā)育

目前為止，只有CLE40和CLV3在其功能缺失時，植株能夠產(chǎn)生相應(yīng)的表型，這可能是CLE motif的高度同源性和表達區(qū)域重合所造成的［40］。轉(zhuǎn)座因子插入CLE40中CLE motif上游時，得到功能缺失突變體cle40-En，其根部表現(xiàn)出明顯的在重力感知和應(yīng)答方面的缺陷，即根發(fā)育變短并且嚴重地向左傾斜，表明CLE40在植物根部發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，同時也暗示CLE40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與激素信號途徑整合在一起，共同調(diào)控植物根向重力生長的過程［40］。CLE40的受體ACR4，其胞外域僅有一個亮氨酸重復(fù)序列，而CLV3的受體CLV1、CLV2和RPK2的胞外域具有多個亮氨酸重復(fù)序列，表明不同類型的受體蛋白激酶參與CLE信號分子的應(yīng)答過程。在cle40和acr4中，呈現(xiàn)出大量柱狀干細胞積累、短根和不規(guī)則形狀根尖的表型［41］，說明CLE40和ACR4具有抑制根頂端分生區(qū)（Root apical meristem，RAM）中干細胞增殖的功能。

WUS的同源 基 因WOX5（WUSCHEL-related homeobox，WOX）僅在RAM的靜止中心（Quiescent

center，QC）表達，具有促進QC區(qū)干細胞增殖的功能。根尖柱狀細胞分泌的CLE40與未分化的柱狀干細胞上的受體ACR4結(jié)合后，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終抑制WOX5的表達，由此形成了一個類似于CLV3-WUS的CLE40-WOX5反饋調(diào)節(jié)環(huán)路來維持RAM干細胞增殖與分化間的平衡［41］（圖1-B）。2013年，在水稻中也發(fā)現(xiàn)了一個類似的信號途徑FCP2p-QHB來調(diào)控RAM中干細胞的發(fā)育，F(xiàn)CP2p和QHB分別與FON2和WOX5具有高度的同源性［42］。CLV3-WUS、CLE40-WOX5和FCP2p-QHB的研究表明，不同CLE家族的成員可以在不同物種的不同分生組織中，啟動相類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控干細胞的增殖和分化。

借助功能獲得技術(shù)發(fā)現(xiàn)CLE的功能和信號途徑中的成員：擬南芥根部異位表達的CLE19和CLE40能夠促進RAM干細胞分化［43］。體外施加多肽CLE19-CLE-motif和CLE40-CLE-motif，均能夠促進RAM干細胞分化［19］，說明CLE19與CLE40一同參與調(diào)控RAM發(fā)育過程。sol2突變體對施加的多肽CLE19-CLE-motif不敏感，SOL2就是在SAM發(fā)育中起重要調(diào)控作用的CRN［28］，暗示與CLV3激活的CRN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相類似，CLE19可能激活SOL2來調(diào)控RAM中干細胞的發(fā)育過程。此外，突變體clv2、crn和rpk2對體外施加的多肽CLE19-CLE-motif和CLE40-CLE-motif均不敏感，說明CLV2、CRN和RPK2介導(dǎo)的信號途徑可能參與RAM中CLE信號分子對干細胞的增殖和分化的調(diào)控過程［19，30，44］。

利用啟動子融合GUS（β-glucuronidase）的方法，檢測在根發(fā)育過程中CLE基因的空間表達模式［45］，結(jié)果表明CLV3啟動子不能夠驅(qū)動GUS報告基因在擬南芥根頂端分生區(qū)表達，而CLE11、CLE13、CLE17和CLE18的啟動子能夠驅(qū)動GUS報告基因在RAM中高效表達，暗示這4個基因可能在RAM發(fā)育的過程中發(fā)揮作用。

2.4 TDIF/CLE41/CLE42/CLE44調(diào)控植物維管（原）形成層發(fā)育

與CLV3、CEL19和CLE40抑制干細胞增殖并促進其分化的功能不同，CLE家族中的其他成員能夠抑制細胞分化。最早從百日草葉肉組織分離到的胞外因子，因其能夠抑制維管形成層干細胞分化成導(dǎo)管分子而得名導(dǎo)管分子分化抑制因子（Tracheary element differentiation inhibitory factor，TDIF）。TDIF編碼一個由132個氨基酸組成的蛋白，在其C端含有CLE家族高度保守的十二肽基序［18］。

擬南芥韌皮部分泌的CLE41和CLE44，其十二肽基序與TDIF的十二肽基序完全相同，CLE42的十二肽基序與TDIF的僅有一個氨基酸不同。向百日草細胞培養(yǎng)體系中體外施加合成的十二肽基序發(fā)現(xiàn)，CLE41、CLE44和CLE42的十二肽基序均能夠發(fā)揮較強的類似于TDIF的功能，抑制維管形成層細胞分化并促進其增殖，造成明顯的導(dǎo)管束斷裂表型，而CLV3的十二肽基序卻具有相反的功能，即促進維管形成層細胞分化成導(dǎo)管分子［18］，揭示這兩條CLE信號途徑可以調(diào)控維管組織導(dǎo)管細胞的發(fā)育過程：TDIF調(diào)控的抑制維管形成層干細胞分化過程和異位CLV3調(diào)控的促進維管形成層干細胞分化過程。

CLE41/CLE44的質(zhì)膜蛋白激酶受體PXY/TDR分布于維管形成層，其分子結(jié)構(gòu)類似于CLV1。cle41和pxy/tdr突變體因形成層干細胞分化成為木質(zhì)部細胞，造成形成層細胞數(shù)量減少［46］。WOX4在維管形成層表達，wox4突變體中形成層細胞數(shù)量減少，表明WOX4對于維持維管形成層干細胞數(shù)量和形成層的形態(tài)是必須的。分子遺傳學(xué)分析說明，WOX4具有促進維管形成層干細胞增殖的作用，CLE41和CLE44也促進WOX4表達來進一步增強干細胞的增殖，而WOX4則對CLE41和CLE44的表達沒有影響［47，48］（圖1-C）。CLE41/CLE44-WOX4對于維管形成層發(fā)育的調(diào)控機制，與CLV3-WUS對于SAM和CLE40-WOX5對于RAM的發(fā)育調(diào)控機制不同，表明在維管形成層和頂端分生區(qū)中干細胞增殖與分化的調(diào)控過程中，具有成員構(gòu)成上相似，但調(diào)控機制不同的特點。最近，發(fā)現(xiàn)一個與PXY/TDR具有同源性的質(zhì)膜類受體蛋白激酶PXY1也參與到維管發(fā)育的過程中，這種模式與多個受體共同應(yīng)答CLV3多肽信使的機制相類似［49］。

2.5 其他CLE基因

利用啟動子融合GUS的方法，發(fā)現(xiàn)CLE8和WOX8在擬南芥種子發(fā)育早期階段的胚和胚乳中表

達。cle8-1突變體中，胚和胚乳細胞數(shù)量減少，暗示CLE8具有促進胚和胚乳細胞增殖的功能。與野生型種子的長和寬相比較，CLE8超表達植株所產(chǎn)生的種子，長和寬均顯著增加；而wox8-1突變體種子的長和寬則顯著減少，并且在CLE8超表達株系中，WOX8的表達量顯著升高，表明CLE8能夠促進WOX8的表達，CLE8-WOX8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與擬南芥種子形態(tài)建成和種子萌發(fā)早期階段胚和胚乳的發(fā)育過程［50，51］（圖1-D），但是目前還未找到CLE8信號分子的質(zhì)膜受體。

擬南芥中超表達CLE19、CLE21、CLE25和CLE22Thr6（十二肽基序第六位的Gly突變?yōu)門hr），表現(xiàn)出生長發(fā)育明顯延遲、植株矮小、蓮座變小和短根等現(xiàn)象；超表達CLE42或CLE44，呈現(xiàn)灌木叢狀、葉片變得小而圓和頂端優(yōu)勢減弱等表型［10，51］，說明CLE在擬南芥發(fā)育過程中的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還有待人們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

在玉米中發(fā)現(xiàn)的CLE基因家族成員Esr1、Esr2和Esr3，其核酸序列具有80%-90%的同源性，并且具有相似的表達模式，即在授粉后的4-28 d內(nèi)僅在靠近胚的胚乳中表達［52］，推測其可能參與玉米早期發(fā)育過程中胚與胚乳之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。2005年，在玉米中發(fā)現(xiàn)CLE家族新的成員Esr-6，推測Esr-6具有在種子發(fā)育早期保護胚的功能，并且在防御細菌和真菌的侵害過程中發(fā)揮作用［53］。目前在水稻中鑒定出13個CLE基因家族成員［13］，在卷柏和小立碗蘚中也分別鑒定出6個和1個CLE家族成員［54］。利用生物信息學(xué)從松柏門下屬8個科中鑒定出93個推測的CLE基因和11個類CLE基因，對系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，它們與其在擬南芥中的同源蛋白之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較近。更為重要的是，存在于TDIF、CLE41和CLE44中的具有抑制維管形成層細胞分化功能的十二肽基序，亦廣泛存在于松柏門下屬的8個科中，并且TDIF的同源蛋白在松樹的韌皮部表達，推測它們亦具有調(diào)控植物維管發(fā)育的功能。調(diào)控維管發(fā)育的CLE基因優(yōu)先在雙子葉植物和松柏門植物的韌皮部表達，暗示在雙子葉植物和裸子植物中調(diào)控維管發(fā)育具有類似的機制［55］。隨著CLE基因在眾多物種中被發(fā)現(xiàn)，揭示出這個家族是在陸生植物進化過程中迅速發(fā)展壯大的。

一直認為CLE基因家族是植物所特有的，但在大豆孢囊線蟲中發(fā)現(xiàn)了一個與CLE同源的蛋白HGSYV46，該蛋白被認為是趨同進化的一個典型代表，推測其是在線蟲入侵大豆根部后分泌的，目的是效仿植物體內(nèi)源的CLE信號分子行使功能，即促進根部細胞轉(zhuǎn)化為線蟲營養(yǎng)來源的合胞體的生成［56］。

3 翻譯后的修飾和加工

大量試驗表明，CLE信號分子存在翻譯后剪切的成熟過程：（1）體外施加CLV3、CLE19和CLE40的CLE-motif均能夠模擬CLV3、CLE19和CLE40超表達的表型，說明CLE motif足以起到相應(yīng)蛋白的作用［19］；（2）CLV3基因進行缺失功能分析和域交換試驗發(fā)現(xiàn)，CLE motif對于CLV3行使功能是必需的，并且不依賴其周邊序列發(fā)揮作用［20，57］；（3）分泌型的絲氨酸蛋白酶參與CLE的成熟過程，如細胞外的蛋白酶subtilisin參與蒺藜苜蓿中CLE36的N端剪切過程［58］，暗示CLE36蛋白前體N端成熟及多肽信號分子穩(wěn)定性的調(diào)控過程在細胞外進行；（4）SOL1編碼的羧肽酶能夠抑制超表達的CLE19對RAM的影響，SOL1在動物體中的同源蛋白能夠切割C端的賴氨酸和精氨酸殘基，參與激素前體和神經(jīng)肽的成熟加工過程，暗示其可能參與CLE家族多肽信使C端的成熟過程［59］；（5）通常CLE只含有一個CLE motif，但是水稻中3個CLE（OsCLE502、OsCLE504和OsCLE506）含有多個CLE motif，每個基序被多聚脯氨酸分隔開［60］，推測不同類型的能作用于多聚脯氨酸序列的肽酶，可能在CLE多肽信號分子成熟的過程中發(fā)揮作用［61］。以上試驗說明CLE信號分子與動物體內(nèi)的多肽信使一樣，先翻譯生成一個無活性的蛋白前體，然后通過多種蛋白酶和肽酶的水解作用，最終釋放出有功能活性的CLE motif。

CLV3十二肽基序中第4和第7位的脯氨酸均有羥基修飾，此修飾對CLV3行使多肽信使功能不是必需的，推測在促進多肽信使的穩(wěn)定性方面起作用。TDIF十二肽基序中第4和第7位的脯氨酸也有羥基化修飾，暗示TDIF與CLV3多肽信使的形成機制相似，也存在翻譯后氨基酸的修飾過程［15，18］。在CLV3超表達株系中，利用nano-LC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CLV3在細胞外行使多肽信使功能的是一個含有2個

羥脯氨酸的由13個氨基酸構(gòu)成的多肽（僅比CLV3的十二肽基序在C端多了一個氨基酸殘基），其中的一個羥脯氨酸帶有阿拉伯糖殘基修飾，表明翻譯后阿拉伯糖的修飾作用，對CLV3行使多肽信使的功能以及與下游受體的結(jié)合起著決定性的作用［62］。以上試驗表明，CLE信號分子在成熟過程中存在氨基酸修飾的過程，說明這些修飾對于維持多肽信使的穩(wěn)定性及發(fā)揮其功能具有促進作用。

4 展望

通過近20年的研究，人們對CLE家族成員的構(gòu)成、分子結(jié)構(gòu)、表達模式、功能和參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有了一定程度的了解。在動物中的多肽信號分子，如TGF-β、EGF和Wnt在植物體內(nèi)沒有同源蛋白，而CLE家族和其他分子量較小的多肽信號分子也是植物獨有的，表明動植物細胞間的多肽信號分子存在較大差異，但是動植物細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制存在一定的共性。例如，受體激酶、蛋白磷酸化酶和Ras超蛋白家族等都可以在動植物細胞內(nèi)共享，表明動植物進化出相似的機制來應(yīng)答細胞間的不同的多肽信號分子。

目前為止，CLE家族中研究的較為透徹的只有 CLV3、FON4/FON2、CLE19、CLE40、TDIF、CLE41和CLE44等少數(shù)成員參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，所以鑒定CLE信號途徑下游的成分成為一個亟待解決的問題。首先需要找到CLE多肽分子的受體，隨著擬南芥基因組測序計劃完成，發(fā)現(xiàn)在植物中存在400多個功能尚不確定的與動物中受體蛋白激酶結(jié)構(gòu)相似的蛋白，故稱為類受體蛋白激酶（Receptor-like kinase，RLK）。已發(fā)現(xiàn)的CLE受體（CLV1、BAM、CLV2、RPK2和ACR4等）均為受體激酶，故推測RLK作為受體在植物細胞間多肽信號分子傳遞中發(fā)揮重要作用［63］。今后借助遺傳學(xué)和生物化學(xué)的相關(guān)技術(shù)。例如，Suppressor screens、Pull down、免疫共沉淀和雙分子熒光互補等，篩選出能夠與CLE相互作用的受體樣蛋白。

細胞內(nèi)的信號組分可能在多個CLE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。例如，受體CLV2可以應(yīng)答CLV3和CLE19；在植物體中普遍表達的蛋白磷酸酶POL可能參與不同的CLE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［32］；MAPK級聯(lián)途徑參與植物中多個LRR-RLKs（包括CLV1）的信號途徑［35］，推測MAPK級聯(lián)途徑可能參與CLE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；WUS及其同源蛋白WOX4、WOX5和WOX8參與CLV3、CLE41/CLE44、CLE40和CLE8的信號途徑，還發(fā)現(xiàn)多個WOX基因家族中的成員具有調(diào)控花發(fā)育［64］、細胞分裂［65］、根尖干細胞發(fā)育［41］及胚發(fā)育［66］的作用，暗示可能存在新的CLE-WOX信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控這些發(fā)育過程，也表明CLE-WOX模式在植物生長發(fā)育過程中具有廣譜性。

研究發(fā)現(xiàn)，PSK能夠同植物生長素和細胞分裂素一起，共同調(diào)節(jié)細胞的去分化和再分化［67］，CLE信號途徑亦存在與植物激素（如生長素和細胞分裂素等）信號途徑交叉或整合的現(xiàn)象：CLE40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑很可能與植物激素信號途徑整合在一起，共同調(diào)控植物根向重力生長的過程［40］；超表達CLE42或CLE44時，頂端優(yōu)勢明顯減弱，暗示CLE42或CLE44可能與生長素一起共同參與植株頂端優(yōu)勢的調(diào)控［10］；CLE10可能通過激活細胞分裂素信號途徑來抑制原生木質(zhì)部導(dǎo)管的形成［68］；對赤霉素缺陷型突變體的莖施加赤霉素，不僅促進其莖的發(fā)育，還能夠促進根的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)施加的赤霉素促進CLE6基因在根中柱中大量表達，在根部表達的CLE6繼而參與調(diào)控莖的生長發(fā)育過程，CLE6和赤霉素究竟是如何長距離地調(diào)控莖和根的發(fā)育過程還需要進一步研究［69］。今后，CLE信號途徑與植物激素信號途徑如何在一起協(xié)同工作，這將是人們所需解決的問題。

相信隨著生物化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)的進一步發(fā)展，以上問題會被逐一解決，多肽信使CLE及其信號途徑中相關(guān)組分的深入研究，必將有利于全面解析CLE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的植物發(fā)育的機理。

［1］Bliss M. The discovery of insulin［M］. Chicago：University of Chicago Press, 1982.

［2］Brivanlou AH, Darnell JE. Signal transduction and the control of gene expression［J］. Science, 2002, 295（5556）：813-818.

［3］Todorovica V, Jurukovskia V, Chena Y, et al. Latent TGF- β binding proteins［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37（1）：38-41.

［4］Gaspar TH, Kevers C, Faivre-Rampant O, et al. Changing concepts in plant hormone action［J］. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 2003, 39（2）：85-106.

［5］Pearce G, Strydom D, Johnson S, et al. A polypeptide from tomato leaves activates the expression of proteinase inhibitor genes［J］. Science, 1991, 253（5022）：895-898.

［6］Matsubayashi Y, Sakagami Y. Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93（15）：7623-7627.

［7］Casson SA, Chilley PM, Topping JE, et al. The POLARIS gene of Arabidopsis encodes a predicted peptide required for correct root growth and leaf vascular patterning［J］. Plant Cell, 2002, 14（8）：1705-1721.

［8］Butenko MA, Patterson SE, Grini PE, et al. INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION controls floral organ abscission in Arabidopsis and identifies a novel family of putative ligands in plants［J］. Plant Cell, 2003, 15（10）：2296-2307.

［9］Narita NN, Moore S, Horiguchi G, et al. Overexpression of a novel small peptide ROTUNDIFOLIA4 decreases cell proliferation and alters leaf shape in Arabidopsis thaliana［J］. Plant J, 2004, 38（4）：699-713.

［10］Strabala TJ, O'Donnell PJ, Smit AM, et al. Gain-of-function phenotypes for many CLAVATA3/ESR genes, including four new family members, correlate with tandem variations in the conserved CLAVATA3/ESR domain［J］. Plant Physiol, 2006, 140（4）：1331-1344.

［11］Fletcher JC, Brand U, Running MP, et al. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristem［J］. Science, 1999, 283（5409）：1911-1914.

［12］Opsahl-Ferstad HG, Le Deunff E, Dumas C, et al. ZmEsr, a novel endosperm-specific gene expressed in restricted region around the maize embryo［J］. Plant J, 1997, 12（1）：235-246.

［13］Chu H, Qian Q, Liang W, et al. The FLORAL ORGAN NUMBER4 gene encoding a putative ortholog of Arabidopsis CLAVATA3 regulates apical meristem size in rice［J］. Plant Physiol, 2006, 142（3）：1039-1052.

［14］Cock JM, Mccormick S. A large family of genes that share homology with CLAVATA3［J］. Plant Physiol, 2001, 126：939-942.

［15］Kondo T, Sawa S, Kinoshita A, et al. A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis［J］. Science, 2006, 313：845-848.

［16］Bowers JE, Chapman BA, Rong JK, et al. Unravelling angiosperm genome evolution by phylogenetic analysis of chromosomal duplication events［J］. Nature, 2003, 422（6930）：433-438.

［17］Sharma VK, Ramirez J, Fletcher JC. The Arabidopsis CLV3-like（CLE）genes are expressed in diverse tissues and encode secreted proteins［J］. Plant Mol Biol, 2003, 51（3）：415-425.

［18］Ito Y, Nakanomyo I, Motose H, et al. Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation［J］. Science, 2006, 313（5788）：842-845.

［19］Fiers M, Golemiec E, Xu J, et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway［J］. Plant Cell, 2005, 17：2542-2553.

［20］Ni J, Clark SE. Evidence for functional conservation, sufficiency, and proteolytic processing of the CLAVATA3 CLE domain［J］. Plant Physiol, 2006, 140（2）：726-733.

［21］Durbak AR, Tax FE. CLAVATA signaling pathway receptors of Arabidopsis regulate cell proliferation in fruit organ formation as well as in meristem［J］. Genetics, 2011, 189：177-194.

［22］Yadav RK, Reddy GV. WUSCHEL protein movement and stem cell homeostasis［J］. Plant Signal Behav, 2012, 7（5）：592-594.

［23］Jonsson H, Heisler M, Reddy GV, et al. Modeling the organization of the WUSCHEL expression domain in the shoot apical meristem［J］. Bioinformatics, 2005, 21（Suppl. 1）：i232-i240.

［24］Müller R, Borghi L, Kwiatkowska D, et al. Dynamic and compensatory responses of Arabidopsis shoot and floral meristem to CLV3 signaling［J］. The Plant Cell, 2006, 18：1188-1198.

［25］Yadav RK, Perales M, Gruel J, et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex［J］. Genes Dev, 2011, 25：2025-2030.

［26］Deyoung BJ, Bickle KL, Schrage KJ, et al. The CLAVATA1-related BAM1, BAM2 and BAM3 receptor kinase-like proteins are required for meristem function in Arabidopsis［J］. Plant J, 2006, 45：1-16.

［27］Guo YF, Han LQ, Hymes M, et al. CLAVATA2 forms a distinct CLE-binding receptor complex regulating Arabidopsis stem cell specification［J］. Plant J, 2010, 63（6）：889-900.

［28］Müller R, Bleckmann A, Simon R. The receptor kinase CORYNE of Arabidopsis transmits the stem cell-limiting signal CLAVATA3

independently of CLAVATA1［J］. Plant Cell, 2008, 20（4）：934-946.

［29］Zhu YF, Wang YQ, Li R, et al. Analysis of interactions among the CLAVATA3 receptors reveals a direct interaction between CLAVATA2 and CORYNE in Arabidopsis［J］. Plant J, 2010, 61：223-233.

［30］Kinoshita A, Betsuyaku S, Osakabe Y, et al. RPK2 is an essential receptor-like kinase that transmits the CLV3 signal in Arabidopsis［J］. Development, 2010, 137（2）：3911-3920.

［31］Stone JM, Trotochaud AE, Walker JC, et al. Control of meristem development by CLAVATA1 receptor kinase and kinase-associated protein phosphatase interactions［J］. Plant Physiol, 1998, 117（4）：1217-1225.

［32］Yu LP, Miller AK, Clark SE. POLTERGEIST encodes a protein phosphatase 2C that regulates CLAVATA pathways controlling stem cell identity at Arabidopsis shoot and flower meristems［J］. Curr Biol, 2003, 13：179-188.

［33］Song SK, Lee MM, Clark SE. POL and PLL1 phosphatases are CLAVATA1 signaling intermediates required for Arabidopsis shoot and floral stem cells［J］. Development, 2006, 133：4691-4698.

［34］Trotochaud AE, Hao T, Wu G, et al. The CLAVATA1 receptorlike kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein［J］. Plant Cell, 1999, 11（3）：393-406.

［35］Betsuyaku S, Takahashi F, Kinoshita A, et al. Mitogen-activated protein kinase regulated by the CLAVATA receptors contributes to shoot apical meristem homeostasis［J］. Plant Cell Physiol, 2011, 52（1）：14-29.

［36］Gish LA, Gagne JM, Brody LH, et al. WUSCHEL-responsive At5g65480 interacts with CLAVATA components in vitro and in transient expression［J］. PLoS One, 2013, 8（6）：e66345.

［37］Yadav RK, Perales M, Gruel J, et al. Plant stem cell maintenance involves direct transcriptional repression of differentiation program［J］. Mol Syst Biol, 2013, 9：654.

［38］Suzaki T, Sato M, Ashikari M, et al. The gene FLORAL ORGAN NUMBER1 regulates floral meristem size in rice and encodes a leucine rich repeat receptor kinase orthologous to Arabidopsis CLAVATA1［J］. Development, 2004, 131（22）：5649-5657.

［39］Kim C, Jeong DH, An G. Molecular cloning and characterization of OsLRK1 encoding a putative receptor-like protein kinase from Oryza sativa［J］. Plant Sci, 2000, 152：17-26.

［40］Hobe M, Müller R, Grünewald M, et al. Loss of CLE40, a protein functionally equivalent to the stem cell restricting signal CLV3, enhances root waving in Arabidopsis［J］. Dev Genes Evol, 2003, 213（8）：371-381.

［41］Stahl Y, Wink RH, Ingram GC, et al. A signaling module controlling the stem cell niche in Arabidopsis root meristems［J］. Curr Biol, 2009, 19（11）：909-914.

［42］Chu HW, Liang WQ, Li J, et al. A CLE-WOX signaling module regulates root meristem maintenance and vascular tissue development in rice［J］. J Exper Botany, 2013, 64（17）：5359-5369.

［43］Fiers M, Hause G, Boutilier K, et al. Mis-expression of the CLV3/ ESR-like gene CLE19 in Arabidopsis leads to a consumption of root meristem［J］. Gene, 2004, 327（1）：37-49.

［44］Wang GD, Long YC, Thomma BP, et al. Functional analyses of the CLAVATA2-like proteins and their domains that contribute to CALVATA2 specificity［J］. Plant Physiol, 2010, 152（1）：320-331.

［45］Jun J, Fiume E, Roeder AH, et al. Comprehensive analysis of CLE polypeptide signaling gene expression and overexpression activity in Arabidopsis［J］. Plant Physiol, 2010, 154（4）：1721-1736.

［46］Etchells JP, Turner SR. The PXY-CLE41 receptor ligand pair defines a multifunctional pathway that controls the rate and orientation of vascular cell division［J］. Development, 2010, 137（5）：767-774.

［47］Hirakawa Y, Kondo Y, Fukuda H. TDIF peptide signaling regulates vascular stem cell proliferation via the WOX4 homeobox gene in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2010, 22（8）：2618-2629.

［48］Qiang Y, Wu JB, Han HB, et al. CLE peptides in vascular development［J］. J Integrative Plant Biol, 2013, 55（4）：389-394.

［49］Wang JH, Kucukoglu M, Zhang LB, et al. The Arabidopsis LRRRLK, PXC1, is a regulator of secondary wall formation correlated with the TDIF-PXY/TDR-WOX4 signaling pathway［J］. BMC Plant Biol, 2013, 13：94.

［50］Fiume E, Fletcher JC. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8［J］. Plant Cell, 2012, 24（3）：1000-1012.

［51］Song XF, Guo P, Ren SC, et al. Antagonistic peptide technology for functional dissection of CLV3/ESR genes in Arabidopsis［J］.

Plant Physiol, 2013, 161：1076-1085.

［52］Bonello JF, Opsahl-Ferstad HG, Perez P, et al. Esr genes show different levels of expression in the same region of maize endosperm［J］. Gene, 2000, 246（1-2）：219-227.

［53］Balandín M, Royo J, Gómez E, et al. A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region［J］. Plant Mol Biol, 2005, 58（2）：269-282.

［54］Floyd SK, Bowman JL. The ancestral developmental tool kit of land plants［J］. Int J Plant Sci, 2007, 168（1）：1-35.

［55］Strabala TJ, Phillips L, West M, et al. Bioinformatic and phylogenetic analysis of CLAVATA3/EMBRYO-SURROUNDING REGION（CLE）and the CLE-LIKE signal peptide genes in the Pinophyta［J］. BMC Plant Biol, 2014, 14：47.

［56］Wang X, Mitchum MG, Gao B, et al. A parasitism gene from a plant-parasitic nematode with function similar to CLAVATA3/ESR（CLE）of Arabidopsis thaliana［J］. Mol Plant Pathol, 2005, 6（2）：187-191.

［57］Fiers M, Golemiec E, van der Schors R, et al. The CLAVATA3/ESR motif of CLAVATA3 is functionally independent from the nonconserved flanking sequences［J］. Plant Physiol, 2006, 141（4）：1284-1292.

［58］Djordjevic MA, Oakes M, Wong CE, et al. Border sequences of Medicago truncatula CLE36 are specifically cleaved by endoproteases common to the extracellular fluids of Medicago and soybean［J］. J Exp Bot, 2011, 62（13）：4649-4659.

［59］Casamitjana-Martínez E, Hofhuis HF, Xu J, et al. Root-specific CLE19 overexpression and the sol1/2 suppressors implicate a CLV-like pathway in the control of Arabidopsis root meristem maintenance［J］. Curr Biol, 2003, 13（16）：1435-1441.

［60］Sawa S, Kinoshita A, Betsuyaku S, et al. A large family of genes that share homology with CLE domain in Arabidopsis and rice［J］. Plant Signal Behav, 2008, 3（5）：337-339.

［61］Lu SW, Chen S, Wang J, et al. Structural and functional diversity of CLAVATA3/ESR（CLE）-like genes from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22（9）：1128-1142.

［62］Ohyama K, Shinohara H, Ogawa-Ohnishi M, et al. A glycopeptide regulating stem cell fate in Arabidopsis thaliana［J］. Nat Chem Biol, 2009, 5（8）：578-580.

［63］Shiu SH, Bleecker AB. Receptor-like kinases from Arabidopsis form a monophyletic gene family related to animal receptor kinases［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98（19）：10763-10768.

［64］Matsumoto N, Okada K. A homeobox gene, PRESSED FLOWER, regulates lateral axis-dependent development of Arabidopsis flowers［J］. Genes Dev, 2001, 15（24）：3355-3364.

［65］Wu X, Dabi T, Weigel D. Requirement of homeobox, gene STIMPY/ WOX9 for Arabidopsis meristem growth and maintenance［J］. Curr Biol, 2005, 15（5）：436-440.

［66］Haecker A, Gross-Hardt R, Geiges B, et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana［J］. Development, 2004, 131（3）：657-668.

［67］Yang H, Matsubayashi Y, Nakamura K, et al. Oryza sativa PSK gene encodes a precursor of phytosulfokine-alpha, a sulfated peptide growth factor found in plants［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96（23）：13560-13565.

［68］Kondo Y, Hirakawa Y, Kieber JJ, et al. CLE peptides can negatively regulate protoxylem vessel formation via cytokinin signaling［J］. Plant Cell Physiol, 2011, 52（1）：37-48.

［69］Bidadi H, Matsuoka K, Sage-Ono K, et al. CLE6 expression recovers gibberellin deficiency to promote shoot growth in Arabidopsis［J］. Plant J, 2014, 78（2）：241-252.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

CLE Peptide Signaling Molecules in Plants

Gao Li
（Hebei Chemical and Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026）

Peptide ligands have long been recognized as signaling molecules which are involved in diverse developmental and physiological processes in animal systems. In recent years, peptide ligands have also well been known signaling molecules in plants, indicating that the function of peptides as singling molecules in inter-cellular communication is evolutionarily conserved. Recently, CLE（CLAVATA3/ EMBRYO SURROUNDING REGION）family is well be researched of signaling molecules in plants. Similar to peptide ligands maturation in animals, the CLE peptides are matured by post-translational proteolysis and modification by studying the CLV3 from Arabidopsis and TDIF from Zinnia. In this review, we outline the molecular characteristics, biological functions and the post-translational maturation of CLE gene family members. We also provide prospective vision in this field.

Peptide signaling molecule CLE peptide family Receptor kinase Signaling pathway Arabidopsis

2014-03-07

河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（QN20131012），河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目（YZ201406），河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士科研項目（BQ32013007）

高麗，女，博士，講師，研究方向：植物發(fā)育分子生物學(xué)；E-mail：cellgao@126.com