葉酸修飾的多壁碳納米管遞藥體系的制備及生物活性研究

王 越，李 禎，李紅玫，周遠航，張秀磊，徐 正

（1.南京大學化學化工學院配位化學國家重點實驗室，江蘇南京210093；2.中國藥科大學理學院，江蘇南京210009）

在傳統(tǒng)的化療治療中，多數(shù)抗癌藥物因其自身的難溶性而無法實現(xiàn)有效的靶向遞送，或在遞送未達作用部位前即被分解。同時，多數(shù)藥物在通過不同方式抑制腫瘤細胞增殖的過程中，對正常細胞的殺傷力也是巨大的，從而引起嚴重副反應。因此，藥物的靶向治療引起人們的關注［1］。碳納米管（CNTs）具有管狀結構，在生物環(huán)境中較球形粒子和片狀粒子更適合作為藥物載體，將其作為納米藥物載體是近年來國內(nèi)外研究的熱點，前景光明。表現(xiàn)為：首先，碳納米管具有良好的柔性，能夠通過彎曲作用增大與細胞的接觸面積［2］；其次，能夠通過主動內(nèi)吞作用或被動擴散的途徑順利跨膜進入細胞內(nèi)［3］；最后，碳納米管表面與藥物分子之間存在著較強的π－π相互作用以及靜電作用，能夠高效負載藥物［4］。但由于碳納米管的強度和韌性高、表面疏水性強、在細胞中易聚集、不能生物降解，在一定程度上限制了其作為藥物載體的應用?；诖?，人們考慮對其進行功能化修飾以提高靶向性、生物相容性和降低毒性。

殼聚糖（CHI）因具備優(yōu)良的生物相容性、微生物降解性及生物安全性等性能而廣泛應用于眾多領域，尤其是在醫(yī)藥材料領域的應用進展很大，與現(xiàn)有的抗癌藥物合用可增強其抗癌效果［5］。此外，殼聚糖結構中存在的羥基、氨基等活性基團可便于進一步地組裝，因此，以殼聚糖修飾碳納米管可提高生物相容性、降低生物毒性并改善水分散性。

另一方面，葉酸受體（FR）介導的靶向給藥系統(tǒng)的研究日趨成熟。葉酸受體可以通過介導細胞內(nèi)吞作用將葉酸（FA）或葉酸－偶聯(lián)物由細胞外轉運到細胞內(nèi)發(fā)揮作用。葉酸受體在許多癌細胞中過度表達，而在正常的器官中很少表達，甚至不表達［6］。通過給藥系統(tǒng)的葉酸與腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體的特異性結合，可以實現(xiàn)葉酸結合物的靶向傳遞，從而減少藥物對正常細胞的損害［7］。同時，大大提高藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度，增強藥物殺死癌細胞的功效，并有效抑制耐藥細胞的產(chǎn)生。

為此，作者先對多壁碳納米管（MWCNTs）進行酸化改性，進而制備出表面經(jīng)殼聚糖－葉酸（CHI－FA）修飾的多壁碳納米管（MWCNTs－CHI－FA）復合納米材料，并以阿霉素（DOX）作為模型藥物，對該納米遞藥體系的生物活性進行了研究。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

MWCNTs（純度＞95%，內(nèi)徑＜8nm，長度0.5～ 2nm），先豐納米材料科技有限公司。

葉酸，嘉興生化試劑有限公司；殼聚糖、二環(huán)己基碳二亞胺（DDC）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、三乙胺，國藥集團化學試劑有限公司；1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺（EDC），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；硝酸（69%）、丙酮、乙醚、醋酸、二甲亞砜（DMSO），南京市化學試劑有限公司；混合磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH＝6.86），上海雷磁創(chuàng)意儀器儀表有限公司；實驗用水為去離子水。DMSO經(jīng)過無水處理，其它溶劑均直接使用。

JEOL－1010型透射電子顯微鏡（日本）；Bruker Vector 22型FTIR光譜儀；UV－2100型紫外可見分光光度儀；Zetasizer Nano ZS型Zeta電位儀（英國馬爾文）；Ⅸ73－U型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 多壁碳納米管的酸化

在100mL的三頸瓶中加入100mg MWCNTs和一定量的硝酸或混酸（濃硫酸∶硝酸＝3∶1），超聲30 min后在一定溫度下回流10h，停止反應，靜置過夜；將上層酸液分離后加蒸餾水稀釋，再次靜置。重復上述操作，將上層水溶液分離后，再向剩余的反應液中加入蒸餾水稀釋，在7 000r·min－1下離心3min，加水稀釋，離心，去除上清液，重復2～3次直至上層液體為墨水色。將上清液分離，所得固體置于紅外燈下干燥過夜，得到酸化MWCNTs。

1.2.2 葉酸活化酯（NHS－FA）的合成

在50mL三頸瓶中加入882mg葉酸、20mL DMSO，攪拌下分別加入縮合劑DDC、NHS和一定量的三乙胺，在氮氣保護下于45℃避光反應過夜。停止反應，將反應液靜置，抽濾除去白色副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，將母液滴入冰冷的30%丙酮的無水乙醚溶液中，待黃色固體析出，過濾，濾餅真空干燥，得到NHSFA。

1.2.3 CHI－FA偶聯(lián)物的合成

稱取一定量的殼聚糖，溶于pH值為4.7的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，緩慢滴加20mg·L－1的NHSFA的DMSO溶液，滴畢，加入一定量的EDC，于45℃暗處避光反應過夜，得到CHI－FA偶聯(lián)物。

1.2.4 MWCNTs－CHI－FA的合成

稱取一定量的酸化MWCNTs溶于15mL蒸餾水中，超聲約20min使其分散均勻。取一定量的CHI－FA偶聯(lián)物溶于20mL DMSO中。將CHI－FA的DMSO溶液緩慢滴加到酸化MWCNTs的水溶液中，加入一定量EDC，攪拌反應24h。離心，取下層固體用乙醇洗滌后置于紅外燈下干燥過夜，得到MWCNTs－CHI－FA。

1.2.5 MWCNTs－CHI－FA裝載阿霉素遞藥體系的制備

稱取一定量MWCNTs－CHI－FA加到蒸餾水中，超聲約20min使其分散均勻；將一定量阿霉素用適量蒸餾水溶解后超聲分散；將二者混合并在室溫下避光反應24h，產(chǎn)物離心干燥，得DOX－MWCNTs－CHIFA納米遞藥體系。

1.2.6 MWCNTs－CHI－FA的載藥性能測定

在490nm處測定不同質量濃度DOX的PBS溶液的紫外吸光度，繪制標準曲線；根據(jù)標準曲線，按下式計算MWCNTs－CHI－FA對DOX的包封率和載藥量［8］：

1.2.7 MWCNTs－CHI－FA的細胞攝取測定

將處于細胞對數(shù)生長期的100μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔約2 000個細胞），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100μL樣品培養(yǎng)基，再置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，最后利用倒置熒光顯微鏡觀測HeLa細胞對MWCNTs－CHI－FA的攝取。

1.2.8 體外MTT細胞增殖測定

將細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為2×104個· mL－1的細胞懸液，將100μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔約2 000個細胞），將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100μL樣品培養(yǎng)基，同時設陰性對照組、陽性對照組；將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，每孔再加入20μL 5mg· mL－1MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO溶解，搖床振蕩10min輕輕混勻；利用酶標儀在490nm處讀出每孔的OD值，計算抑制率。

1.3 測試與表征

用透射電子顯微鏡（加速電壓為200kV）觀察樣品的形貌；用紅外光譜儀（分辨率2cm－1，KBr壓片）測定樣品的紅外光譜；用紫外可見分光光度儀（掃描波長為200～600nm）測定樣品的紫外可見吸收光譜；用Zeta電位儀測定樣品的Zeta電位值。

2 結果與討論

2.1 Zeta電位值分析

測定表明：與對照樣MWCNTs相比，酸化MWCNTs的Zeta電位值由32.4mV降至－28.2mV，這是因為其表面帶有羧基而呈現(xiàn)負電性。

2.2 紅外光譜分析（圖1）

圖1 酸化MWCNTs（a）和相關產(chǎn)物（b）的紅外光譜Fig.1 The IR spectra of acidified MWCNTs（a）and the related products（b）

由圖1可知，酸化MWCNTs在1 640cm－1處為C＝O的伸縮振動吸收峰，在3 400cm－1處為O－H伸縮振動吸收峰；殼聚糖在1 635cm－1、1 549cm－1處分別出現(xiàn)了殼聚糖酰胺Ⅰ譜帶和酰胺Ⅱ譜帶；NHSFA在1 710cm－1處出現(xiàn)了酯羰基的特征吸收峰；而CHI－FA在1 590cm－1處出現(xiàn)了酰胺羰基的特征吸收峰，在1 400～1 600cm－1處出現(xiàn)了芳環(huán)的吸收峰，在3 460～3 353cm－1處出現(xiàn)了O－H伸縮振動及N－H伸縮振動重疊而增寬的多重吸收峰，證實該化合物確為NHS－FA與殼聚糖偶聯(lián)得到。

2.3 紫外吸收光譜分析（圖2）

圖2 FA和CHI－FA偶聯(lián)物的紫外吸收光譜Fig.2 The UV absorption spectra of FA and CHI－FA

由圖2可知，CHI－FA偶聯(lián)物的紫外吸收光譜中，由于葉酸的羧基與殼聚糖的氨基反應形成了酰胺鍵，削弱了葉酸分子內(nèi)的共軛效應，所以葉酸中363nm處的吸收峰消失，290nm處的吸收峰位移到320nm左右，僅在255nm處仍顯示了葉酸的特征吸收峰。表明葉酸已與殼聚糖成功偶聯(lián)。

2.4 透射電鏡分析（圖3）

圖3 酸化MWCNTs（a）、MWCNTs－CHI－FA（b，c，d）的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 The TEM images of acidified MWCNTs（a），MWCNTs－CHI－FA（b，c，d）

由圖3可知，酸化MWCNTs內(nèi)徑約為6nm，且無明顯的納米管團聚現(xiàn)象（圖3a），這表明殘余的金屬粒子以及無定形碳等雜質在酸化過程中被有效除去；在包覆了CHI－FA偶聯(lián)物以后，MWCNTs外層明顯增厚，管徑約為26nm，內(nèi)部的中空管狀結構依舊清晰可見（圖3b）。這表明CHI－FA已成功修飾到了MWCNTs表面。

進一步對制備MWCNTs－CHI－FA時各組分的配比進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在MWCNTs∶CHI∶FA（質量比，下同）為1∶1.8∶4時，所得MWCNTs－CHI－FA分散性良好，MWCNTs外壁被均勻包覆，無明顯的葉酸分子殘留和殼聚糖團聚現(xiàn)象（圖3c）；而MWCNTs∶CHI∶FA為1∶2.4∶14時，有大量葉酸殘留，在MWCNTs表面形成不規(guī)則分布（圖3d）。

2.5 MWCNTs－CHI－FA對DOX的裝載

計算表明，MWCNTs－CHI－FA對DOX的包封率為44.7%、載藥量為12.5%。

2.6 MWCNTs－CHI－FA的細胞攝取

將載藥后的MWCNTs－CHI－FA復合體系與He－La細胞共同孵化24h后，通過倒置熒光顯微鏡進行觀測，結果見圖4。

圖4 DOX－MWCNTs－CHI－FA與HeLa細胞孵化24h后倒置熒光顯微照片F(xiàn)ig.4 The inversion fluorescence microphotographs of DOX－MWCNTs－CHI－FA incubated with HeLa cells for 24h

由圖4可知，孵化24h后DOX已經(jīng)完全進入細胞核，呈現(xiàn)明亮的紅色（圖4b中的白點）。

2.7 體外活性實驗

采用葉酸受體表達水平有明顯差異的子宮頸癌HeLa細胞、肺腺癌A549細胞作為標靶模型，利用MTT法測定DOX－MWCNTs－CHI－FA納米遞藥體系的體外細胞抑制活性，結果見圖5。

圖5 DOX－MWCNTs－CHI－FA對腫瘤細胞HeLa和A549的體外抑制活性Fig.5 The inhibition activity of DOX－MWCNTs－CHI－FA against tumour cells HeLa and A549 in vitro

由圖5可知，DOX－MWCNTs－CHI－FA對葉酸受體過度表達［FR（＋）］的HeLa細胞具有良好的抑制活性，對葉酸受體表達較低［FR（－）］的A549細胞抑制活性相對較弱，即DOX－MWCNTs－CHI－FA對于FR水平不同的腫瘤細胞具有明顯的選擇性。

2.8 作用機理分析

分析DOX－MWCNTs－CHI－FA對腫瘤細胞具有選擇性抑制活性的可能的作用機理，見圖6。

圖6 作用機理Fig.6 The action mechanism

3 結論

通過酸化以改善多壁碳納米管的水溶性及反應活性，合成了生物相容性良好且具有靶向遞藥功能的MWCNTs－CHI－FA復合納米材料，以阿霉素為模型藥進行裝載，發(fā)現(xiàn)該遞藥體系對葉酸受體表達較高的HeLa腫瘤細胞具有良好的體外抑制活性。為進一步研發(fā)碳納米管載藥體系提供了有價值的實驗基礎。

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